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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于水稻RNAi载体pHANNIBAL双酶切的问题请教
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shuangzi8761

银虫 (著名写手)

[求助] 关于水稻RNAi载体pHANNIBAL双酶切的问题请教 已有1人参与

小弟最近做水稻RNAi，用pHANNIBAL构建中间载体，pCAMBIA1300做表达载体，正反片段为200bp，选择插入位点正向为EcoR1&Xho1,反向为Hind3&Xba1, 两个载体连接选用Pst1和Sac1。问题在用Pst1和Sac1双酶切pHANNIBAL时，电泳出现了四条带。。。。。。双酶切后应该为3300bp大小。。。这两个酶在载体上都是单一的酶切位点，为何出现了四条带。。。。插入的RNAi基因片段上也没有这俩酶切位点啊，非常奇怪，请各位虫友指点一二。。。不胜感谢

电泳图第一泳道为PLUS2的maker,从上到下为8k 5k 3k 2k 1k 750bP 500bp 250bp 100bp
第二泳道为pCAMBIA1300的Pst1和Sac1双酶切
第三泳道为pHANNIBAL的Pst1和Sac1双酶切

图为pHANNIBAL图谱

关于水稻RNAi载体pHANNIBAL双酶切的问题请教
pHANNIBAL_1x.png


关于水稻RNAi载体pHANNIBAL双酶切的问题请教-1
QH{@5SM__]Q[W3TUZX7O5CV.jpg
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1楼 2014-05-25 17:21:07
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-25 20:05:26
shuangzi8761: 金币+2, ★有帮助 2014-05-26 09:21:06
你有没有检测空载体？有可能有插入了，插入片段测序了没？

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2楼2014-05-25 19:06:00
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shuangzi8761

银虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-25 19:06:00
你有没有检测空载体？有可能有插入了，插入片段测序了没？

空载体是向Biovector公司买的 自己基因插入后做了PCR和酶切验证 是没问题的
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3楼2014-05-26 09:20:34
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by shuangzi8761 at 2014-05-26 09:20:34
空载体是向Biovector公司买的 自己基因插入后做了PCR和酶切验证 是没问题的...

拿到载体后做酶切检测没？

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4楼2014-05-26 09:50:42
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shuangzi8761

银虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-26 09:50:42
拿到载体后做酶切检测没？
...

没有呢啊 想着既然从公司买的 没有问题吧
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5楼2014-05-26 11:02:19
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by shuangzi8761 at 2014-05-26 11:02:19
没有呢啊 想着既然从公司买的 没有问题吧...

那个难说的，他们也是从别人那收集的，不一定没问题哦

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6楼2014-05-26 11:04:42
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shuangzi8761

银虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-26 11:04:42
那个难说的，他们也是从别人那收集的，不一定没问题哦
...

五点多大洋买的呀。。。。我切一个试试 看看怎么样 多谢了
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7楼2014-05-26 11:18:33
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shuangzi8761

银虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-26 11:04:42
那个难说的，他们也是从别人那收集的，不一定没问题哦
...

我用pst1和sac1分别单酶切 没问题 双酶切也没问题 我的插入的基因里面也没有这俩酶切位点 奇怪了。。。。。。。
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8楼2014-05-27 09:01:44
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