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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » siRNA转染效率
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jiangyinshen

木虫 (著名写手)

[求助] siRNA转染效率 已有2人参与

请教各位大神，敝人从上海吉玛订的siRNA（A套餐），其中包括NC-FAM，于是这几天按照invitrogen的protocol做了转染，但是转染24h和48h均未观察到荧光，视野下一片漆黑，什么都没有，不知道是什么原因，百思不得其解！
转染过程严格避光，不存在猝灭问题，我将siRNA贮存液（20umol）滴到载片上置于荧光显微镜下观察，绿色荧光非常强烈，说明试剂有效，但是我就是想不通为什么转染48h还没有一点荧光，求各路高手解答，谢谢！

附我的转染步骤：我做的是子宫内膜间质细胞，种在6孔板，细胞均匀分布，接种24h之内细胞密度达到70%左右做的转染。（1）转染前30min按1.5ml/孔给细胞换液，放回孵箱；（2）每孔250ul无血清培养基溶解5ul siRNA，轻柔混匀，室温静置5min；（3）每孔250ul无血清培养基溶解10ul Lipofectamin2000，轻柔混匀，室温静置5min；（4）将充分溶解的siRNA和Lipofectamin2000混合，轻柔混匀，室温静置20min；（5）将上述混合物加入孔板中，完成转染。转染后6h用完全培养基换液。转染后24h、48h、72h和96h分别收取细胞沉淀，NC-FAM组在荧光显微镜下观察，检测转染效率。

[ 来自小组 生物医药家族 ]
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不是風動，亦非幡動，仁者心動
1楼 2013-05-15 20:42:10
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chnfhjxl

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2013-05-18 07:44:28
jiangyinshen: 金币+2, ★有帮助 2013-05-18 19:53:33
我和你做的差不多，不过是6小时换液的时候就观察荧光，到没有等到24小时。可以看得到转进去了。要不你6小时换液的时候看看有没有荧光。有可能换液啊之内的操作的时候猝灭了。但是按道理24小时也可以看得到的。尽量减少lipo2000的剧烈操作
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2楼2013-05-17 13:30:25
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jiangyinshen

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chnfhjxl at 2013-05-17 13:30:25
我和你做的差不多，不过是6小时换液的时候就观察荧光，到没有等到24小时。可以看得到转进去了。要不你6小时换液的时候看看有没有荧光。有可能换液啊之内的操作的时候猝灭了。但是按道理24小时也可以看得到的。尽量减 ...

问题是我全程严格避光的啊
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3楼2013-05-18 19:54:23
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dongxie1982

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

转染前更换的培养液也是无抗无血清？4~6h就可以观察到了不需再更换培养液
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4楼2013-05-19 11:02:58
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chnfhjxl

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by jiangyinshen at 2013-05-18 19:54:23
问题是我全程严格避光的啊...

这样啊，那你六小时的时候检测一下试试。有可能荧光素到细胞内被细胞消化掉了，嘿嘿，我也是瞎猜猜啊，我们实验室都是6小时就查荧光，所以我不清楚24小时有没有影响
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5楼2013-05-19 12:31:24
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jiangyinshen

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dongxie1982 at 2013-05-19 11:02:58
转染前更换的培养液也是无抗无血清？4~6h就可以观察到了不需再更换培养液

转染前是用加双抗的完全培养基换液的，请问有何不妥？
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不是風動，亦非幡動，仁者心動
6楼2013-05-20 23:36:06
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dongxie1982

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

虽然2000说是在血清双抗条件下不影响转染，但实际影响还是大，所以还是用无血清无抗条件下做
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7楼2013-05-22 17:12:25
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jiangyinshen

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by dongxie1982 at 2013-05-22 17:12:25
虽然2000说是在血清双抗条件下不影响转染，但实际影响还是大，所以还是用无血清无抗条件下做

受教了，多谢
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8楼2013-05-26 13:33:39
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wyn20122065

新虫 (初入文坛)
我和你一样买的是吉玛的A套餐，请问一下这个里面的FAM标记阴性对照是干什么的？如何使用啊？谢谢了，本人新手，不太懂!
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9楼2013-07-17 20:54:27
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panjianqqcn

新虫 (初入文坛)
1.Lipofectamin2000已经是个很古老的东西了，siRNA转染建议你用Life的RNAi MAx转染试剂，这个效率是大家公认的，关于国产的siRNA转染试剂，我不想说太多，劝大家不要去尝试，这个不是从洋媚外，差距是真实存在的；
2.Fam-NC是看转染效率的，因为fam是化学合成的荧光基团，曝光太久会淬灭的，所以保存的是棕色的管子，培养箱也要避光，必须是6小时换液的时候看，如果楼主要看看是淬灭了还是没转染进去，你可以在换液前看一下荧光，如果有荧光就证明没有淬灭，换液后荧光要是没有了那就是没转染进去呀，这个道理大家懂吧；
3.关于siRNA套装，强烈像大家推荐Transheep的siRNA套装，性价比超高，4个靶点的套装比其他公司3个的优惠，还有礼品送，大家可以去订购一下试试！
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10楼2015-05-04 01:02:07
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