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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教siRNA转染的几个问题
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未末

新虫 (初入文坛)

[求助] 请教siRNA转染的几个问题 已有3人参与

各位战友好~~~~~我是一名研究生新生，悲催的要做siRNA，但是我们实验室又没有这方面经验和技术，于是只能自己摸索了。。有些菜鸟级的问题，还请各位专家高手不吝赐教！！！

     
       ①在做siRNA电泳和转染等等实验时，血清，培养液，胰酶等培养物质如何去除RNase？ 还是新开封的应该没有RNase呢，但是用了几次之后呢？
       ②siRNA很容易降解，那么可以对含siRNA的聚合物纳米粒做诸如粒径、透射电镜、紫外等等实验吗（目的是考察siRNA跟我们实验用聚合物复合成的纳米粒的性质）？
       ③siRNA 跟DNA的性质差别有多大？DNA的转染可否模拟siRNA?做转染实验可以先用eGFP,PGL-3之类的DNA报告基因来检测我的聚合物的转染效率吗？
       ④关于转染浓度。园子里的专家们说siRNA的作用浓度是10~100nM。但是我们从公司买来的总共才5nmol，就要近两千块了，这么用怎么吃得消啊。。。求助浓度用pmol级的可以吗？
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1楼 2011-11-10 13:35:21
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未末

新虫 (初入文坛)
自己顶一下~~
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2楼2011-11-10 15:58:43
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2011加油

银虫 (正式写手)
我也想设计siRNA，请问你是怎么设计，来确定想要的siRNA片段？谢谢回答，期待回复。
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每天都是新开始，2011，要好好努力！
3楼2011-11-11 14:32:22
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未末

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 2011加油 at 2011-11-11 14:32:22:
我也想设计siRNA，请问你是怎么设计，来确定想要的siRNA片段？谢谢回答，期待回复。

这个不是我设计的，呵呵，不好意思了~~真桑心，木有人回复。。。
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4楼2011-11-14 13:41:04
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2011加油

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 未末 at 2011-11-14 13:41:04:
这个不是我设计的，呵呵，不好意思了~~真桑心，木有人回复。。。

你们实验室买的是现成的吗？这也很好啊，省去很多麻烦
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每天都是新开始，2011，要好好努力！
5楼2011-11-14 20:01:22
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未末

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 2011加油 at 2011-11-14 20:01:22:
你们实验室买的是现成的吗？这也很好啊，省去很多麻烦

是的呀说~~~
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6楼2011-11-21 10:52:14
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704361326

金虫 (正式写手)

恩恩

【答案】应助回帖

我也刚做不久，相互讨论
1. 这个可以考虑，但没办法。枪尖、EP管类制品要用进口的。你可以看进口ep的包装盒，是去RNase的哦！
2.我也会大不了
3. 我觉得可以，我也正准备这样尝试。原因：目的RNA很贵，我有其他的，就先尝试做转染，虽然有差别，但大致相通啊。

以上建议，仅作参考。
我也在做siRNA,你好像是药剂方向的。多多讨论哦！
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踏踏实实地走好自己的路
7楼2015-05-26 17:12:19
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fenggeshj

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 704361326 at 2015-05-26 17:12:19
我也刚做不久，相互讨论
1. 这个可以考虑，但没办法。枪尖、EP管类制品要用进口的。你可以看进口ep的包装盒，是去RNase的哦！
2.我也会大不了
3. 我觉得可以，我也正准备这样尝试。原因：目的RNA很贵，我有其他的 ...

你好,请问你有做过SiRNA的细胞增殖实验吗?我刚开始做SiRNA,不知道该用多少浓度.希望得到指导.谢谢～
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8楼2015-07-23 09:15:22
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zbxky

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

siRNA转染常见问题及解决方案

1.        RNA与转染试剂比例不佳
由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。
RNA浓度和转染试剂量的优化(24well)

1         2         3         4
RNA工作浓度         25nM         50nM         100nM         150nM
每孔RNA的量(pmol)         0.17μg
(12.5pmol)         0.33μg
(25pmol)         0.67μg
(50pmol)         1μg
(75pmol)
每孔转染试剂量         0.25μl         0.5μl         1μl         1.5μl

2.        细胞密度不佳
调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这时转染效率和总的细胞数量就很重要，一般细胞数量较少时转染效率高。由于siRNA沉默时效性的影响，转染后48小时才能进行进行qRT-PCR检测，转染后48-72小时才能进行蛋白检测。如果转染时铺板密度较高，细胞一方面转染效果不理想，直接影响沉默效果和数据可靠性，另一方面，48小时甚至更长时间后，沉默检测最佳点时，过于密集的细胞将影响细胞状态，从而影响实验结果。
3.        RNA效率不高
选择最优RNA，并采用已知高效的RNA做对照。siRNA的合成需要注意的是一定要选用高纯度的siRNA，siRNA的纯度直接关系到转染效率和沉默效率。siRNA的工作浓度和siRNA的设计、细胞种类、目标基因有关。建议一定进行相关的预实验优化各条件。
4.        RNA酶污染
建议无RNA酶和内毒素的吸头、离心管和溶液等材料和实验器具。
5.        转染后培养时间不够
在mRNA水平可以到48小时以后验证结果，在蛋白水平可以到72小时后验证结果。siRNA的沉默效果是有时效性的，在最佳的时间点观察，会得到更加明显的沉默效果，这个时间点的确定不能以同一株细胞转染DNA的经验确定，因为一个是消耗mRNA，一个是产生mRNA。对转染siRNA，在核酸水平，转染后8-48小时，即可观察到mRNA水平的逐步下降，一般来说，转染后48小时进行qRT-PCR检测通常会得到漂亮的结果。
6.        培养基毒性
采用含10-20%血清的全培养基。使用脂质体等转染试剂时，由于含血清转染会将血清中的蛋白带入细胞，引发细胞毒性，导致转染效率降低，故不能有血清转染。EntransterTM只浓缩包裹核酸不会将血清带入细胞，所以可以有血清转染，同时由于血清的存在，有利于细胞的状态维护，故能提高转染效率。
7.        细胞污染
建议彻底清洁所有细胞培养相关用品

原文来源：http://www.engreen.cn/
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9楼2015-08-26 10:31:55
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zbxky

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可以电话咨询英格恩010-68489824
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10楼2015-09-23 09:36:46
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