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[求助]
请教siRNA转染的几个问题 已有3人参与
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各位战友好~~~~~我是一名研究生新生，悲催的要做siRNA，但是我们实验室又没有这方面经验和技术，于是只能自己摸索了。。有些菜鸟级的问题，还请各位专家高手不吝赐教！！！ ①在做siRNA电泳和转染等等实验时，血清，培养液，胰酶等培养物质如何去除RNase？ 还是新开封的应该没有RNase呢，但是用了几次之后呢？ ②siRNA很容易降解，那么可以对含siRNA的聚合物纳米粒做诸如粒径、透射电镜、紫外等等实验吗（目的是考察siRNA跟我们实验用聚合物复合成的纳米粒的性质）？ ③siRNA 跟DNA的性质差别有多大？DNA的转染可否模拟siRNA?做转染实验可以先用eGFP,PGL-3之类的DNA报告基因来检测我的聚合物的转染效率吗？ ④关于转染浓度。园子里的专家们说siRNA的作用浓度是10~100nM。但是我们从公司买来的总共才5nmol，就要近两千块了，这么用怎么吃得消啊。。。求助浓度用pmol级的可以吗？ |
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2楼2011-11-10 15:58:43
3楼2011-11-11 14:32:22
4楼2011-11-14 13:41:04
5楼2011-11-14 20:01:22
6楼2011-11-21 10:52:14
7楼2015-05-26 17:12:19
8楼2015-07-23 09:15:22
【答案】应助回帖
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siRNA转染常见问题及解决方案 1. RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。 RNA浓度和转染试剂量的优化(24well) 1 2 3 4 RNA工作浓度 25nM 50nM 100nM 150nM 每孔RNA的量(pmol) 0.17μg (12.5pmol) 0.33μg (25pmol) 0.67μg (50pmol) 1μg (75pmol) 每孔转染试剂量 0.25μl 0.5μl 1μl 1.5μl 2. 细胞密度不佳 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这时转染效率和总的细胞数量就很重要，一般细胞数量较少时转染效率高。由于siRNA沉默时效性的影响，转染后48小时才能进行进行qRT-PCR检测，转染后48-72小时才能进行蛋白检测。如果转染时铺板密度较高，细胞一方面转染效果不理想，直接影响沉默效果和数据可靠性，另一方面，48小时甚至更长时间后，沉默检测最佳点时，过于密集的细胞将影响细胞状态，从而影响实验结果。 3. RNA效率不高 选择最优RNA，并采用已知高效的RNA做对照。siRNA的合成需要注意的是一定要选用高纯度的siRNA，siRNA的纯度直接关系到转染效率和沉默效率。siRNA的工作浓度和siRNA的设计、细胞种类、目标基因有关。建议一定进行相关的预实验优化各条件。 4. RNA酶污染 建议无RNA酶和内毒素的吸头、离心管和溶液等材料和实验器具。 5. 转染后培养时间不够 在mRNA水平可以到48小时以后验证结果，在蛋白水平可以到72小时后验证结果。siRNA的沉默效果是有时效性的，在最佳的时间点观察，会得到更加明显的沉默效果，这个时间点的确定不能以同一株细胞转染DNA的经验确定，因为一个是消耗mRNA，一个是产生mRNA。对转染siRNA，在核酸水平，转染后8-48小时，即可观察到mRNA水平的逐步下降，一般来说，转染后48小时进行qRT-PCR检测通常会得到漂亮的结果。 6. 培养基毒性 采用含10-20%血清的全培养基。使用脂质体等转染试剂时，由于含血清转染会将血清中的蛋白带入细胞，引发细胞毒性，导致转染效率降低，故不能有血清转染。EntransterTM只浓缩包裹核酸不会将血清带入细胞，所以可以有血清转染，同时由于血清的存在，有利于细胞的状态维护，故能提高转染效率。 7. 细胞污染 建议彻底清洁所有细胞培养相关用品 原文来源：http://www.engreen.cn/ |
9楼2015-08-26 10:31:55
10楼2015-09-23 09:36:46
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