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jiangyinshen木虫 (著名写手)
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siRNA转染效率已有2人参与
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请教各位大神，敝人从上海吉玛订的siRNA（A套餐），其中包括NC-FAM，于是这几天按照invitrogen的protocol做了转染，但是转染24h和48h均未观察到荧光，视野下一片漆黑，什么都没有，不知道是什么原因，百思不得其解！ 转染过程严格避光，不存在猝灭问题，我将siRNA贮存液（20umol）滴到载片上置于荧光显微镜下观察，绿色荧光非常强烈，说明试剂有效，但是我就是想不通为什么转染48h还没有一点荧光，求各路高手解答，谢谢！ 附我的转染步骤：我做的是子宫内膜间质细胞，种在6孔板，细胞均匀分布，接种24h之内细胞密度达到70%左右做的转染。（1）转染前30min按1.5ml/孔给细胞换液，放回孵箱；（2）每孔250ul无血清培养基溶解5ul siRNA，轻柔混匀，室温静置5min；（3）每孔250ul无血清培养基溶解10ul Lipofectamin2000，轻柔混匀，室温静置5min；（4）将充分溶解的siRNA和Lipofectamin2000混合，轻柔混匀，室温静置20min；（5）将上述混合物加入孔板中，完成转染。转染后6h用完全培养基换液。转染后24h、48h、72h和96h分别收取细胞沉淀，NC-FAM组在荧光显微镜下观察，检测转染效率。 [ 来自小组 生物医药家族 ] |
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2楼2013-05-17 13:30:25
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8楼2013-05-26 13:33:39
9楼2013-07-17 20:54:27
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1.Lipofectamin2000已经是个很古老的东西了，siRNA转染建议你用Life的RNAi MAx转染试剂，这个效率是大家公认的，关于国产的siRNA转染试剂，我不想说太多，劝大家不要去尝试，这个不是从洋媚外，差距是真实存在的； 2.Fam-NC是看转染效率的，因为fam是化学合成的荧光基团，曝光太久会淬灭的，所以保存的是棕色的管子，培养箱也要避光，必须是6小时换液的时候看，如果楼主要看看是淬灭了还是没转染进去，你可以在换液前看一下荧光，如果有荧光就证明没有淬灭，换液后荧光要是没有了那就是没转染进去呀，这个道理大家懂吧； 3.关于siRNA套装，强烈像大家推荐Transheep的siRNA套装，性价比超高，4个靶点的套装比其他公司3个的优惠，还有礼品送，大家可以去订购一下试试！ |
10楼2015-05-04 01:02:07