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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 碱性蛋白Native-PAGE
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

[求助] 碱性蛋白Native-PAGE

现在老板让做蛋白的Native-PAGE，但是我们实验室之前没有人做这个，查资料又有好多地方不明白，不知道哪位大侠有这方面的经验，传授一下
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1楼 2013-05-14 09:22:51
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-15 08:32:40
你的蛋白的等电点是多少？普通的native-PAGE的样品、buffer里没有SDS，所以只能靠本身蛋白所带电荷跑，如果是碱性蛋白的话很可能根本不向正极跑。你需要跑在负极电泳缓冲液/样品中引入一些负电荷，比方说blue-nativ ...

您对非变性胶熟悉吗？我的蛋白的等电点都在8点多，用酸性非变性胶跑过了，但是没有什么条带。
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4楼2013-05-25 15:37:41
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-26 01:44:04
蛋白是应该向正极跑，打错了。...

这个我知道，那您有跑过碱性蛋白的非变性胶吗？知道碱性蛋白非变性胶的配方吗？！
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7楼2013-05-26 08:50:56
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-26 14:50:33
你做的酸性非变性胶是一种方法。就是注意要把电极反向连接。因为蛋白是带正电荷的，所以会向负极跑。
配方如下：
1. 分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7%，丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺=37.5:1 ）
2. stackin ...

我也按这个配方跑过电泳了，也是没有条带，我跑非变性胶就是想要看看我的蛋白有没有形成多聚体，BN-PAGE应该要怎么做呢？！
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9楼2013-05-26 15:48:06
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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10楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-27 00:49:43
单体是多大呢？BN-PAGE一般看不到分子量小的蛋白，一般可以看到多聚体或者是蛋白复合物。胶的配方和做法可以参考下面的文献。
Cline and Mori (2001) J Cell Biol 154:719-729...

单体的分子量在20-30kd
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11楼2013-05-27 08:32:04
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-28 07:59:22
分子量有些小，BN胶上可以看到50左右的。我觉得小于30不太好。不过你可以试试增加胶的浓度。...

恩，看看吧，我还想问就是native-page跑完电泳以后需要固定蛋白吗？！
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13楼2013-05-28 08:41:11
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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14楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-29 07:07:00
你想染色的话是要固定的。不过考染的染液本身有固定作用，不用特意去固定。...

那都有哪些固定方法呢？！戊二醛固定蛋白可以吗？！
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15楼2013-05-29 08:32:37
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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16楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-30 06:07:38
蛋白一般是用甲醇-醋酸固定。...

现在貌似不是固定的问题了，我感觉是我的蛋白直接没有往胶里跑，用已知的碱性蛋白纯品做了对照，这个对照是有条带的，但是我的目的蛋白一点条带都没有，这会是什么原因呢？！
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17楼2013-05-30 18:51:41
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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18楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-31 08:34:43
你的样品是膜蛋白吗？如果是膜蛋白，需要用弱的去垢剂增溶，否则蛋白在脂分子里，跑不下来的。

应该不是膜蛋白吧，是用大肠杆菌表达的重组蛋白，在破碎上清里
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19楼2013-05-31 08:42:42
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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20楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-01 04:28:24
你跑的样品是纯化的重组蛋白还是从组织里提取的蛋白？如果是重组蛋白，可溶的话应该没问题，如果是从组织里提取的样品，需要知道是否结合在膜上。...

纯化的重组蛋白，应该不是膜蛋白
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21楼2013-06-01 08:40:37
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