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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 碱性蛋白Native-PAGE
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

[求助] 碱性蛋白Native-PAGE

现在老板让做蛋白的Native-PAGE，但是我们实验室之前没有人做这个，查资料又有好多地方不明白，不知道哪位大侠有这方面的经验，传授一下
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1楼 2013-05-14 09:22:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-05-26 15:48:06
我也按这个配方跑过电泳了，也是没有条带，我跑非变性胶就是想要看看我的蛋白有没有形成多聚体，BN-PAGE应该要怎么做呢？！...

单体是多大呢？BN-PAGE一般看不到分子量小的蛋白，一般可以看到多聚体或者是蛋白复合物。胶的配方和做法可以参考下面的文献。
Cline and Mori (2001) J Cell Biol 154:719-729
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10楼2013-05-27 00:49:43
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
飘零的叶子(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-14 10:59:47
native gel 顾名思义就是蛋白在胶上的迁移率除了受到分子量的影响还受到蛋白结构的影响。在配置蛋白ｎａｔｉｖｅ　ｇｅｌ的时候讲所有ｂｕｆｆｅｒ中的ＳＤＳ去除，且电泳液中也不能有ＳＤＳ，其次是蛋白ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ　中也不能有ＳＤＳ，且上样之前不需要经过蒸煮变性步骤。最后电泳过程中稍注意一下电泳温度（一般建议冰浴跑）。
祝好你好运
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2楼2013-05-14 10:14:07
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
飘零的叶子: 金币+5 2013-05-25 15:33:31
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-05-25 21:50:05
你的蛋白的等电点是多少？普通的native-PAGE的样品、buffer里没有SDS，所以只能靠本身蛋白所带电荷跑，如果是碱性蛋白的话很可能根本不向正极跑。你需要跑在负极电泳缓冲液/样品中引入一些负电荷，比方说blue-native PAGE、hrCN-PAGE、Deriphat-PAGE。
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3楼2013-05-15 08:32:40
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-15 08:32:40
你的蛋白的等电点是多少？普通的native-PAGE的样品、buffer里没有SDS，所以只能靠本身蛋白所带电荷跑，如果是碱性蛋白的话很可能根本不向正极跑。你需要跑在负极电泳缓冲液/样品中引入一些负电荷，比方说blue-nativ ...

您对非变性胶熟悉吗？我的蛋白的等电点都在8点多，用酸性非变性胶跑过了，但是没有什么条带。
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4楼2013-05-25 15:37:41
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励分享经验 2013-05-28 08:24:10
引用回帖:
4楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-05-25 15:37:41
您对非变性胶熟悉吗？我的蛋白的等电点都在8点多，用酸性非变性胶跑过了，但是没有什么条带。...

我是做过一些非变性胶。碱性蛋白背身在中性条件下带正电，而电泳的基本原理是要让蛋白带上负电荷才能向下跑的，普通SDS-PAGE因为有SDS与蛋白的作用，蛋白表面是带有负电荷的。如果你做native-PAGE，蛋白本身的电荷不能让其往负极跑。你必须加一些较弱的去垢剂，比方说脱氧胆酸钠（clear native），或者是考马斯亮蓝（blue native）。
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5楼2013-05-26 01:39:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-26 01:39:03
我是做过一些非变性胶。碱性蛋白背身在中性条件下带正电，而电泳的基本原理是要让蛋白带上负电荷才能向下跑的，普通SDS-PAGE因为有SDS与蛋白的作用，蛋白表面是带有负电荷的。如果你做native-PAGE，蛋白本身的电荷 ...

蛋白是应该向正极跑，打错了。
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6楼2013-05-26 01:44:04
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-26 01:44:04
蛋白是应该向正极跑，打错了。...

这个我知道，那您有跑过碱性蛋白的非变性胶吗？知道碱性蛋白非变性胶的配方吗？！
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7楼2013-05-26 08:50:56
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励积极交流 2013-05-28 08:24:38
引用回帖:
7楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-05-26 08:50:56
这个我知道，那您有跑过碱性蛋白的非变性胶吗？知道碱性蛋白非变性胶的配方吗？！...

你做的酸性非变性胶是一种方法。就是注意要把电极反向连接。因为蛋白是带正电荷的，所以会向负极跑。
配方如下：
1. 分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7%，丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺=37.5:1 ）
2. stacking胶：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125%，丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺=3:1）
3. 电泳缓冲液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5

如果你要做的蛋白形成多聚体或者是分子量比较大，可以试试BN-PAGE。
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8楼2013-05-26 14:50:33
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-26 14:50:33
你做的酸性非变性胶是一种方法。就是注意要把电极反向连接。因为蛋白是带正电荷的，所以会向负极跑。
配方如下：
1. 分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7%，丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺=37.5:1 ）
2. stackin ...

我也按这个配方跑过电泳了，也是没有条带，我跑非变性胶就是想要看看我的蛋白有没有形成多聚体，BN-PAGE应该要怎么做呢？！
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9楼2013-05-26 15:48:06
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