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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 扩增引物有关
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sls19881024

银虫 (小有名气)

[求助] 扩增引物有关

大家帮我看一一下这一对引物可用嘛？一般引物要达到啥样的标准~~~最近一直使用这对引物PCR，一直没有条带，会不会是引物的原因啊？下面是用DNAMAN来评估的结果，望大家帮忙给出意见~~~
Two primers complementarity.
Max complementarity in continuous: 5 bp, free energy=-2.00 Kcal/mol
5'-GGATCCATGTCAACAGTTTTTGTTAATG-3'
                      |||||
3'-GAGACAACTAACTAACTTGAAACAGCTG-5'



Max complementarity in discontinuous: 9 bp
              5'-GGATCCATGTCAACAGTTTTTGTTAATG-3'
                  || |  |||| ||
3'-GAGACAACTAACTAACTTGAAACAGCTG-5'
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小松
1楼 2013-05-10 15:39:09
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sls19881024: 金币+5, ★有帮助 2013-05-11 08:34:50
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-05-11 09:41:38
引物做什么用？荧光定量的话肯定不行的。一般的克隆应该可以。
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2楼2013-05-11 07:01:11
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意孤城_

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sls19881024(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-11 14:54:05
gyesang: 回帖置顶 2013-05-11 14:54:09
P不出来不单单是引物的问题，你的目的条带多少决定你的延伸时间，反应体系合不合理，引物和模版的量合不合适，退火温度行不行都要考虑。
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3楼2013-05-11 10:06:15
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86964109

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sls19881024(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-11 14:54:17
sls19881024: 金币+2, ★有帮助 2013-05-11 15:33:08
sls19881024: 金币+9, ★★★很有帮助 2013-05-14 08:03:22
你的反应条件怎么设置的，产物大小是多少？这个可能影响你的实验结果。另外你的引物二聚体有点严重啊，如果是定量PCR的话，在重新设计一对吧，还有能确定你的模板好用吗，内参验证过么？有阳性对照么？
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4楼2013-05-11 13:53:38
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sls19881024

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 86964109 at 2013-05-11 13:53:38
你的反应条件怎么设置的，产物大小是多少？这个可能影响你的实验结果。另外你的引物二聚体有点严重啊，如果是定量PCR的话，在重新设计一对吧，还有能确定你的模板好用吗，内参验证过么？有阳性对照么？

产物大小1038bp，不是用来定量的   扩开放阅读框，模板内参验证很好~~~
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小松
5楼2013-05-11 15:34:45
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86964109

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sls19881024 at 2013-05-11 15:34:45
产物大小1038bp，不是用来定量的   扩开放阅读框，模板内参验证很好~~~...

如果是RT-PCR扩增cDNA模板，就有点麻烦了，首先确定你的基因在所用的模板中是高表达么，设计一对短片段引物验证一下吧，也可以侧面验证获得的cDNA模板质量是否够好，是否足够完整，剩下就是调整PCR程序，最好再设计一对引物同时做，也可以做二次PCR，如果还不行就利用酶切位点把目的片段分成2段扩
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6楼2013-05-13 08:38:11
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sls19881024

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-11 07:01:11
引物做什么用？荧光定量的话肯定不行的。一般的克隆应该可以。

你好    我想问一下，这种参数要在什么范围就能够达到标准啊？Two primers complementarity.
Max complementarity in continuous: 5 bp, free energy=-2.00 Kcal/mol
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小松
7楼2013-05-15 20:04:30
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by sls19881024 at 2013-05-15 20:04:30
你好    我想问一下，这种参数要在什么范围就能够达到标准啊？Two primers complementarity.
Max complementarity in continuous: 5 bp, free energy=-2.00 Kcal/mol...

也没有什么固定标准。一般的引物，只要不是连续超过8bp应该可以P出来的。而且，互补的位置也会影响PCR，一般希望引物的3'端最好不要形成互补。如果是做荧光定量，引物的质量要求比较高，这些结构越少越好。
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8楼2013-05-15 23:48:00
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