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wshcf7

金虫 (小有名气)

[求助] HPLC纯度分析

各位老虫,我最近在做一抗体片段的纯度分析(一类新药,没有标准品),参照药典三部上一般运用电泳和分子排阻HPLC法进行分析,电泳法没什么问题,就是在运用液相分析时不是太清楚相关情况,忘有了解的虫友发表下自己的意见,谢谢了!
1. 我们的样品里面有单体、二倍体和多倍体同时存在,实验的目的是要得出单体和二倍体的含量
2.我用常规的缓冲盐溶液进行分析时,根本得不出结果,峰形非常差;而将样品用6M盐酸胍处理后,便能得到理想的峰图和纯度结果

而药典上其他类型的单抗或者重组药物在用分子排阻HPLC法分析纯度时,一般的PBS缓冲液或者PBS含有1%异丙醇即可,。请问将样品用盐酸胍处理后进行HPLC纯度分析的方法是否可行,在进行新药申报时会不会遇到麻烦啊?因为6M盐酸胍时蛋白已经变性了;另外,缓冲盐中加入1%异丙醇的作用是什么,是否会使蛋白变性?
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wshcf7

金虫 (小有名气)

没人知道啊
2楼2013-03-20 14:51:46
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happyqilu

新虫 (初入文坛)


【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zhychen2008: 金币+1, 多谢参与 2013-03-20 22:50:20
wshcf7: 金币+2, 有帮助, 是的,Tosoh的柱子有用过,貌似Sepax的柱子耐受性要好一些? 2013-03-21 13:38:57
曾经看到G3000的柱子说明,可以用尿素等一类的变性剂,但长时间会影响柱效!既然是一类新药,你说了算,你的检测方法就是正宗,呵呵
3楼2013-03-20 15:13:17
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4楼2013-03-20 15:40:14
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feng100381

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
变性条件下多倍体不会分开吗?
蛋白
5楼2013-03-20 16:27:56
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axiao105

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
痴夷子皮: 金币+1, 谢谢交流,欢迎常来哦。 2013-03-21 08:20:21
wshcf7: 金币+2, 有帮助, 谢谢!多聚体已经控制在5%之内了,通过SDS-PAGE判断的;请问盐酸胍还有可能造成多聚体形成么?不太清楚啊 2013-03-21 13:43:30
怎么确定多聚体不是盐酸胍引起的?
纯化工艺能尽量去掉多聚体么,可能会引起免疫原性
numb
6楼2013-03-20 17:28:01
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lzgxgz

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wshcf7: 金币+4, 谢谢!是不是可以理解为若聚合体不含二硫键的话,6M盐酸胍就会使聚合体变为单体? 2013-03-21 13:46:25
6m胍时,不见得变性,但是多聚体肯定不存在了。
异丙醇目的好像是减少吸附。
7楼2013-03-21 08:27:51
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wshcf7

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by feng100381 at 2013-03-20 16:27:56
变性条件下多倍体不会分开吗?

多倍体会不会分开我自己也不太清楚,但是二倍体是通过二硫键形成的,应该不会分开的
8楼2013-03-21 13:40:43
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zhangrj920

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
zhychen2008: 金币+1, 多谢参与 2013-03-21 20:08:31
二硫健还原剂  乙二硫醇  氧化剂 双氧水 典
9楼2013-03-21 17:16:48
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wshcf7

金虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by zhangrj920 at 2013-03-21 17:16:48
二硫健还原剂  乙二硫醇  氧化剂 双氧水 典

10楼2013-03-22 13:44:02
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