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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » [求教]关于RNAi载体的最终确定序列问题
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伤何处

木虫 (正式写手)

[交流] [求教]关于RNAi载体的最终确定序列问题

最近在构建植物RNAi载体，通过BP反应将基因转入了pHGRV载体里面，然后得到很多克隆。但不知道怎么测序确定序列，因为重组入载体里的基因是反向重复的两个，中间是内含子。想问下大家都是怎么确定的?  也可以通过测序，但加起来估计有3Kb,,,S所以想问下大家是否有其他更好的方法。欢迎交流~
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1楼2013-03-16 22:06:16
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伤何处

木虫 (正式写手)
顶一个~
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2楼2013-03-17 13:55:37
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
伤何处: 金币+2 2013-03-17 22:58:15
若不需要完全知道LR反应后得到表达载体上的序列，只是检测插入片段是否连上，可以测一下，测出有回文结构即可，或单引物PCR检测
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3楼2013-03-17 22:50:29
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伤何处

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 香菱儿 at 2013-03-17 22:50:29
若不需要完全知道LR反应后得到表达载体上的序列，只是检测插入片段是否连上，可以测一下，测出有回文结构即可，或单引物PCR检测

你好~但我想确定序列，避免发生点突导致个别位点序列不一样。。这怎么办？
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4楼2013-03-17 22:58:10
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yxwjimmy

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
伤何处: 金币+2 2013-03-19 08:26:40
那就亚克隆测序吧
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5楼2013-03-19 00:28:39
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伤何处

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yxwjimmy at 2013-03-19 00:28:39
那就亚克隆测序吧

你好，谢谢~ 就是另外在载体上设计引物，分别测这两个片段么？
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6楼2013-03-19 08:27:15
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potata

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
前面实验非常肯定的话做个酶切检测一下就可以，不放心就做单引物测序，我就是这么做的。顺便想问下，有pHGRV载体图谱吗？方便的话给传一个看看。
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7楼2013-08-13 11:20:33
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伤何处

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by potata at 2013-08-13 11:20:33
前面实验非常肯定的话做个酶切检测一下就可以，不放心就做单引物测序，我就是这么做的。顺便想问下，有pHGRV载体图谱吗？方便的话给传一个看看。

嗯嗯，我就是单引物测序确定的。我把序列跟图谱都发给你把~图谱是我自己弄得，不是很好看哈
[求教]关于RNAi载体的最终确定序列问题
pHGRV Map.png
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    • 2013-08-13 11:53:23, 172.52 K
8楼2013-08-13 11:53:41
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