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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白纯化
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jiapingshk

铜虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白纯化

我用镍柱纯化下来的蛋白在冻融一两次后，大部分蛋白就发生沉淀了，这是为什么？有方法避免吗？
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1楼 2013-03-02 15:21:01
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

饼哥

木虫 (正式写手)
洗脱下来的蛋白液先存放于4℃，取少量样品马上用SDS-PAGE检测纯化效果，若纯化合格，立刻用透析法除去目的蛋白洗脱液中的咪唑。若有必要，还需用PEG包埋法或超滤法浓缩目的蛋白，提高蛋白浓度，因为蛋白质浓度过低会让蛋白质不稳定。最后将蛋白300-500μL/管分装，冻存于-80℃。还有，纠正你提及的一点，原核系统表达的蛋白，若是包涵体，则不具活性；而若是可溶性，则蛋白是有活性的，万不可一概而论。本人擅长用镍离子亲和层析纯化蛋白，有什么问题可以直接QQ我。
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爱科研，更爱小木虫！
9楼2013-03-05 13:50:14
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jiapingshk: 金币+10, ★有帮助 2013-03-04 16:24:41
蛋白一般是不稳定的，需要低温保存，温度越低，保存的时间久越长，而反复冻融会使蛋白质结构被破话。
甘油可以降低体系的极性，体系的极性降低了，有助于蛋白结构稳定；第二，甘油可以降低体系的凝固点，这样利于蛋白在低温下保存，如果不加甘油的话，蛋白反复冻融数次就会失活，甚至变性
同样能够起到保护作用的保护剂还有很多，吐温20、一些氨基酸等等
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6楼2013-03-04 14:35:31
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普通回帖

jiangyhai

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
加5-50%的甘油试试。
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静心做事。
2楼2013-03-02 20:52:49
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jiapingshk

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jiangyhai at 2013-03-02 20:52:49
加5-50%的甘油试试。

为什么会沉淀呢？跟咪唑浓度有关吗？
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3楼2013-03-03 09:45:25
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崔士元

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
蛋白反复冻融会不会失活？蛋白失活应会沉淀吧
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男人，就要对自己狠一点！
4楼2013-03-03 14:06:18
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jiapingshk

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 崔士元 at 2013-03-03 14:06:18
蛋白反复冻融会不会失活？蛋白失活应会沉淀吧

我是用原核表达系统表达的蛋白，本身就没有活性呀。
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5楼2013-03-04 11:37:48
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zyx335588

捐助贵宾 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jiapingshk at 2013-03-04 11:37:48
我是用原核表达系统表达的蛋白，本身就没有活性呀。...

蛋白的保存有很多方法，依蛋白的性质不同，其是否能够冻存也不一定，这都需要试验来摸索，。某些蛋白有可能在冻存过程中发生了结构的变化，产生你说的沉淀现象，建议你加一些甘油试试，如果还不行则建议你换用其他保存方式。各种方法保存后后的蛋白活性如何这也需要与新鲜的蛋白样品做活性对照试验。
另外，除非你确定你的蛋白需要翻译后修饰等才有活性，否则不能给笼统的说元和表达的蛋白都没有活性。现在的好多试验用蛋白样品都是通过原核表达获得的，包扩一些生物医药产品。
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7楼2013-03-05 09:25:52
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)
冻存蛋白之前，透析咪唑了没？我发现蛋白样品中存在咪唑的时候，冻融会加剧蛋白的絮状沉淀。因此建议你除掉咪唑，加5%甘油，液氮速冻。同时，我都是分装保存，每次拿出来一小管用，减少冻融次数。
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8楼2013-03-05 09:30:37
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lovececilly

铜虫 (初入文坛)
纯化后测过蛋白浓度吗？有可能蛋白浓度过高，可以再加洗脱液稀释一下。
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10楼2013-03-05 22:10:33
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