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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 细菌转化实验
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cuicchao

金虫 (正式写手)

[求助] 细菌转化实验

做了好几次老出现这样的结果感觉很是不对啊，大家觉得这是怎么了？？？？？[ Last edited by cuicchao on 2013-2-28 at 10:20 ]
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好心态；年轻派
1楼 2013-02-28 08:34:10
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回帖置顶 ( 共有1个 )

mascotte

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2013-02-28 19:02:42
看起来不像是连接产物的转化，更像是质粒直接转化（扩增）的结果。另一种可能就是培养基的抗生素失效，导致无筛选的生长造成的。第一种情况需要确定质粒是否已经完全切开，第二种情况需要在涂板时做阴性对照，即同时用未转化的感受态细胞涂板，如果对照板有克隆，说明抗生素无效。
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5楼2013-02-28 12:13:09
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普通回帖

cuicchao

金虫 (正式写手)
大家帮忙，看下第二个图片，第一个传错了
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好心态；年轻派
2楼2013-02-28 10:21:43
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mangmanglulu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
2楼: Originally posted by cuicchao at 2013-02-28 10:21:43
大家帮忙，看下第二个图片，第一个传错了

涂得多了 可以考虑划线
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3楼2013-02-28 10:56:53
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cuicchao

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mangmanglulu at 2013-02-28 10:56:53
涂得多了 可以考虑划线...

我具体这么做的：0.5微升的质粒，4.5微升的目的基因链接，50微升的DH5菌热激转化，加了900微升的LB培养基，225rpm,摇菌1小时，之后经过离心弃去700的培养基，余下的200微升左右重悬，吸取30微升涂的板子。之前也这么涂过，结果也挺好的。那么如果是这菌多了的缘故，里面成功转化的概率大不大啊？
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好心态；年轻派
4楼2013-02-28 11:08:49
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cuicchao

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by mascotte at 2013-02-28 12:13:09
看起来不像是连接产物的转化，更像是质粒直接转化（扩增）的结果。另一种可能就是培养基的抗生素失效，导致无筛选的生长造成的。第一种情况需要确定质粒是否已经完全切开，第二种情况需要在涂板时做阴性对照，即同时 ...

谢谢，对于是不是质粒的直接连接问题可以排除，因为我用的质粒是通过双酶切回收的质粒，酶切效果还可以。下次做一个阴性对照看看。
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好心态；年轻派
6楼2013-02-28 14:55:53
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lhs521521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌液浓度高了，80rpm，1h；50ul菌液+200ulLB；
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寻找真正的自我！
7楼2013-02-28 14:59:17
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-03-01 13:37:52
你涂得太多了，建议涂现在量的五分之一甚至十分之一吧。涂得太多了就不好挑单克隆了。不太像抗生素失效，如果是抗生素失效，会比现在长得更多的，会一片一片的根本看不出来。要么涂太多，要么假阳性太多，呵呵。挑几个看看吧
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8楼2013-02-28 15:01:55
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mangmanglulu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by cuicchao at 2013-02-28 11:08:49
我具体这么做的：0.5微升的质粒，4.5微升的目的基因链接，50微升的DH5菌热激转化，加了900微升的LB培养基，225rpm,摇菌1小时，之后经过离心弃去700的培养基，余下的200微升左右重悬，吸取30微升涂的板子。之前也这 ...

你的抗生素用的什么？
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9楼2013-03-01 12:40:28
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cuicchao

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by mangmanglulu at 2013-03-01 12:40:28
你的抗生素用的什么？...

氨苄青霉素，这几天挑了单克隆，5个克隆里面有一个克隆通过PCR扩增出了条带。
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好心态；年轻派
10楼2013-03-04 17:19:37
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