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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 同源克隆 出条带后测序结果很纠结
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budinggguodu

金虫 (初入文坛)

[求助] 同源克隆 出条带后测序结果很纠结

我同源克隆后做了胶回收 然后连接转化后测序
后来又拿胶回收产物又PCR了一次 再回收连接转化测序
结果这两次结果不一样 并且都不是要的条带 本人新虫 想求助一下 我不会是挑了杂菌了吧。。。可是菌落PCR不管是M13还是特异的引物 都出来了很亮的条带。纠结了 是不是本来引物就不好 扩出来的条带就不是想要的目的条带呢。。。唉 祝大家试验顺利。。
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1楼 2013-01-25 16:48:05
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cnliu51

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物特异性不高，或PCR时退火温度低造成的。
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2楼2013-01-26 06:18:01
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cxt86

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
budinggguodu: 金币+1, ★有帮助 2013-01-28 13:01:38
budinggguodu: 金币+1, ★有帮助, 谢谢你啦 测序结果确实有个反向的 可惜我反向试了试还是在NCBI里面找不到条带很惆怅。。。准备换个引物再试试吧 同源克隆好惆怅啊。。。祝你一切顺利 2013-02-14 21:33:41
LZ说的这个很亮的条带是指什么？条带大小和你预期的一样吗？M13是不是比特异引物稍稍长一点？如果楼主是新虫，弱弱的问一下,是TA克隆吗？那样的测序结果没有方向性，可能需要反向互补。希望对您有帮助。
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3楼2013-01-27 04:32:04
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budinggguodu

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cxt86 at 2013-01-27 04:32:04
LZ说的这个很亮的条带是指什么？条带大小和你预期的一样吗？M13是不是比特异引物稍稍长一点？如果楼主是新虫，弱弱的问一下,是TA克隆吗？那样的测序结果没有方向性，可能需要反向互补。希望对您有帮助。

菌落PCR条带很亮 但是大小和最一开始的不太一样 不过是月牙形的 所以觉得大小好像不准 M13的 倒是比特异性的长一些 总体是对的 但是挑了很多菌 出来的条带都不在同一个水平线上。。。。是TA克隆 什么叫反向互补啊？是说反向插入载体吗？哦 有道理 我再试试看不过 谢谢你
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4楼2013-01-28 13:01:17
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