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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何充分形成发卡结构
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无形居士2009

金虫 (正式写手)

[求助] 如何充分形成发卡结构

想把DNA单链通过退火使发卡结构形成，可是跑胶后发现有一部分二聚体的形成~~急求各位大侠们，如何使它形成发卡结构，同时避免二聚体的行程呢？退火温度怎么控制？？有经验的同学们分享一下吧~
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1楼 2012-12-27 09:35:50
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hongfan

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
无形居士2009: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-12-27 10:27:51
PCR快速升温至90摄氏度，保持5min，再缓慢降温，每降5度，停2-3分钟
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123
2楼2012-12-27 09:49:16
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无形居士2009

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hongfan at 2012-12-27 09:49:16
PCR快速升温至90摄氏度，保持5min，再缓慢降温，每降5度，停2-3分钟

我不是做pcr的  我就是退货形成发卡结构 不想要二聚体呀 有什么建议么
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3楼2012-12-27 09:51:39
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hongfan

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 无形居士2009 at 2012-12-27 09:51:39
我不是做pcr的  我就是退货形成发卡结构 不想要二聚体呀 有什么建议么...

不是PCR，而是用PCR仪去做啊，不用PCR怎么annealing呢，
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123
4楼2012-12-27 11:56:55
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wen1023tao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
无形居士2009: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-12-27 14:05:09
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-12-27 16:57:45
可以再PCR仪上95度10min，然后缓慢降温到退火温度，65度左右 ，立即拿出来在室温自然缓慢冷却30min，然后做连接
这个是我当时构建RNAi时用的体系，可以试试，希望有所帮助，还有就是要死引物序列不好，形成二聚体是不可避免的
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5楼2012-12-27 12:27:09
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无形居士2009

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wen1023tao at 2012-12-27 12:27:09
可以再PCR仪上95度10min，然后缓慢降温到退火温度，65度左右 ，立即拿出来在室温自然缓慢冷却30min，然后做连接
这个是我当时构建RNAi时用的体系，可以试试，希望有所帮助，还有就是要死引物序列不好，形成二聚体是 ...

我购买的DNA链同过IDT软件模拟可以形成发卡结构 我在用来杂交之前先在金属浴中90℃退火5min 保证该发卡结构的形成 然后在加入到溶液中去，实验室没有做PCR  也没有PCR仪   我只是单纯的想要发卡结构 不想要二聚体 可是它形成了呀
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6楼2012-12-27 14:07:45
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wen1023tao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
无形居士2009: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-12-27 16:38:53
小丹木木: 金币+4, 鼓励应助 2012-12-27 16:57:57
引用回帖:
6楼: Originally posted by 无形居士2009 at 2012-12-27 14:07:45
我购买的DNA链同过IDT软件模拟可以形成发卡结构 我在用来杂交之前先在金属浴中90℃退火5min 保证该发卡结构的形成 然后在加入到溶液中去，实验室没有做PCR  也没有PCR仪   我只是单纯的想要发卡结构 不想要二聚体  ...

没有PCR仪比较麻烦，需要高温让DNA变性，形成二聚体的DNA解链成单链，慢慢退火降温的复性过程中，就可以最大程度上形成发夹结构，实在不行用干浴锅或者水浴锅代替，一个94度，一个65度，只是这样没有做过，不知道效果怎么样，降温过程不能降得太快，要在退火温度那里停留下，尽量让发夹结构形成，否则还没来得及形成发夹就过温度，立马复性，很多地方随意配对 ，发夹结构就更少了
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7楼2012-12-27 15:41:21
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无形居士2009

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by wen1023tao at 2012-12-27 15:41:21
没有PCR仪比较麻烦，需要高温让DNA变性，形成二聚体的DNA解链成单链，慢慢退火降温的复性过程中，就可以最大程度上形成发夹结构，实在不行用干浴锅或者水浴锅代替，一个94度，一个65度，只是这样没有做过，不知道效 ...

嗯哪 谢咯  我试试 希望能出现好的结果~~
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8楼2012-12-27 16:38:17
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wangliually

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hongfan at 2012-12-27 09:49:16
PCR快速升温至90摄氏度，保持5min，再缓慢降温，每降5度，停2-3分钟

试过，好像没多大的用啊
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9楼2015-07-12 17:08:52
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归零162312

木虫 (小有名气)
楼主问题后来解决了吗，最近我也在搞这个
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10楼2015-10-20 17:23:43
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