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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » qPCR总出现非特异性扩增，到底是怎么回事？
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messi1910

铜虫 (初入文坛)

[求助] qPCR总出现非特异性扩增，到底是怎么回事？

1. 我提取了两个样品的RNA，然后反转录为cDNA；
2. 通过普通的PCR检测引物和cDNA情况，显示特异性很好，单带，如下图：
3. 我在qPCR的时候扩增曲线的重复性还是不错的，但是溶解曲线就不好了，总是有个小峰，就是所谓的非特异性扩增吧，几乎所有的靶标都是这样的，actin内参也是的，但这个内参，我原来用也可以啊，没这种情况；难道这是模板的问题，但我的普通PCR扩增的还挺好的啊；

请大家帮我分析下什么原因，和qPCR的设置我想没太大的关系吧。

普通PCR



溶解曲线



让我伤心的1
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1楼 2012-12-12 13:07:13
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

henryxue

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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messi1910: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-12-13 08:53:09
可能是引物二聚体的关系，如果你担心小峰影响你的定量，从你这张图上来看，可以先在77度（即小峰和大峰之间的温度）hold 5s，然后再读荧光值
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3楼2012-12-12 21:06:34
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chenguestc

木虫 (职业作家)
可以试下提高温度，我的样品在60度，63度就是两个PEAK, 65度就很干净的一个峰了
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11楼2012-12-13 09:54:55
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普通回帖

涌动的泉

铜虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
实在不行就，多设几对引物，然后挑出特异性最好的，普通的PCR只能看大概，它的结果不代表qPCR的
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我们的过去，成就了如今的我们，无需悔恨
2楼2012-12-12 16:45:58
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p53jun

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不如Taqman?或者商业SYBR Green 2x mix?
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4楼2012-12-13 00:27:56
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luobugou

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
逆转录的时候可能形成了二聚体
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5楼2012-12-13 03:48:00
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bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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messi1910: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-12-13 08:53:28
把引物浓度减少点，实在不行就做两步法，把温度升高
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6楼2012-12-13 04:20:06
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messi1910

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by luobugou at 2012-12-13 03:48:00
逆转录的时候可能形成了二聚体

如果这样的话，但为什么我普通的PCR没有非特异性扩增呢，
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7楼2012-12-13 08:46:21
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
7楼: Originally posted by messi1910 at 2012-12-13 08:46:21
如果这样的话，但为什么我普通的PCR没有非特异性扩增呢，...

荧光PCR检测非常灵敏。普通PCR能看到条带时早就过了荧光检测的阈值了。在普通PCR下看不到引物二聚体只能说明引物二聚体浓度没有达到检测限度，不能说就没有。
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8楼2012-12-13 08:52:05
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messi1910

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by henryxue at 2012-12-12 21:06:34
可能是引物二聚体的关系，如果你担心小峰影响你的定量，从你这张图上来看，可以先在77度（即小峰和大峰之间的温度）hold 5s，然后再读荧光值

其实我看定量结果，基本上和我预测的符合的还比较好，这样的结果可以用吗？77度hold 5s这个是在melt curve stage设置吧，怎么设置啊，请教下
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9楼2012-12-13 08:52:38
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henryxue

木虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by messi1910 at 2012-12-13 08:52:38
其实我看定量结果，基本上和我预测的符合的还比较好，这样的结果可以用吗？77度hold 5s这个是在melt curve stage设置吧，怎么设置啊，请教下...

符合的话那也可以不用去折腾，当然如果遇到好的引物那是最好的
hold 5s指在72度扩增完以后，再加一步75度5s，然后再去读荧光值，然后进行到下一个cycle
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10楼2012-12-13 08:58:11
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