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messi1910

铜虫 (初入文坛)

[求助] qPCR总出现非特异性扩增,到底是怎么回事?

1. 我提取了两个样品的RNA,然后反转录为cDNA;
2. 通过普通的PCR检测引物和cDNA情况,显示特异性很好,单带,如下图:
3. 我在qPCR的时候扩增曲线的重复性还是不错的,但是溶解曲线就不好了,总是有个小峰,就是所谓的非特异性扩增吧,几乎所有的靶标都是这样的,actin内参也是的,但这个内参,我原来用也可以啊,没这种情况;难道这是模板的问题,但我的普通PCR扩增的还挺好的啊;

请大家帮我分析下什么原因,和qPCR的设置我想没太大的关系吧。

普通PCR



溶解曲线



让我伤心的1
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

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引用回帖:
7楼: Originally posted by messi1910 at 2012-12-13 08:46:21
如果这样的话,但为什么我普通的PCR没有非特异性扩增呢,...

荧光PCR检测非常灵敏。普通PCR能看到条带时早就过了荧光检测的阈值了。在普通PCR下看不到引物二聚体只能说明引物二聚体浓度没有达到检测限度,不能说就没有。
8楼2012-12-13 08:52:05
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涌动的泉

铜虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

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实在不行就,多设几对引物,然后挑出特异性最好的,普通的PCR只能看大概,它的结果不代表qPCR的
我们的过去,成就了如今的我们,无需悔恨
2楼2012-12-12 16:45:58
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henryxue

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


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messi1910: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-12-13 08:53:09
可能是引物二聚体的关系,如果你担心小峰影响你的定量,从你这张图上来看,可以先在77度(即小峰和大峰之间的温度)hold 5s,然后再读荧光值
3楼2012-12-12 21:06:34
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p53jun

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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不如Taqman?或者商业SYBR Green 2x mix?
4楼2012-12-13 00:27:56
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