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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » qPCR总出现非特异性扩增，到底是怎么回事？
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chenguestc

木虫 (职业作家)
可以试下提高温度，我的样品在60度，63度就是两个PEAK, 65度就很干净的一个峰了
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11楼2012-12-13 09:54:55
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solomon7811

新虫 (小有名气)
应该是引物二聚体。可以考虑换引物，或者考虑使用去除引物二聚体的一些商业试剂。
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12楼2012-12-13 10:09:36
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dayulee

木虫 (正式写手)

愚木虫
退火温度 原因很大吧
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好好学习，天天向上
13楼2012-12-14 10:00:43
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stewart3261

铜虫 (小有名气)
你用的是什么扩增试剂盒，有时不见的是引物不好，试剂盒不好也会出现这种非特异性扩增的！
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14楼2012-12-14 12:34:09
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zhoulubin

银虫 (小有名气)
你用的两步法还是三步法？
适当提高一下退火温度
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每个年龄都有其最应该做的事，但只有过了那个年龄自己才知道
15楼2012-12-14 21:30:58
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messi1910

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by stewart3261 at 2012-12-14 12:34:09
你用的是什么扩增试剂盒，有时不见的是引物不好，试剂盒不好也会出现这种非特异性扩增的！

takara的，这个是之前老板批量买的
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16楼2012-12-19 08:58:45
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messi1910

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by zhoulubin at 2012-12-14 21:30:58
你用的两步法还是三步法？
适当提高一下退火温度

我用的是3步法，95° 3s，58° 15s，72° 15s，一共40个循环，退火温度最高达到60°已经比较高了吧，还有两步法一般退火和延伸温度设多少啊，多长时间呢
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17楼2012-12-19 09:00:52
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stewart3261

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by messi1910 at 2012-12-19 08:58:45
takara的，这个是之前老板批量买的...

你的前辈们做的怎么样？！
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18楼2012-12-19 09:56:21
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txw87

木虫 (小有名气)
同学，请你把PCR和qPCR的条件列出来比较一下退火温度
你的qPCR用的反应体系和普通PCR的体系应该不同，所以不可以设置相同的退火温度，要优化

另外，你应该把你做的空白对照的扩增曲线及Melting Curve拿出来给大家看看，如果小峰是空白管就有的，那么很可能是引物二聚体。如果空白的Ct值和你的样本Ct值相差10以上的话，这个小峰就不用管它。

你要是嫌图不好看，就像其他人建议的那样，Melting Curve温度设置从77度开始
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19楼2012-12-19 13:07:20
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zhoulubin

银虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by messi1910 at 2012-12-19 09:00:52
我用的是3步法，95° 3s，58° 15s，72° 15s，一共40个循环，退火温度最高达到60°已经比较高了吧，还有两步法一般退火和延伸温度设多少啊，多长时间呢...

参照试剂说明书，不同仪器不一样。
一般两步法是95℃，30s预变性；95℃，5s；60℃，30s，这是TaKaRa试剂对ABI的机器
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每个年龄都有其最应该做的事，但只有过了那个年龄自己才知道
20楼2012-12-19 20:34:12
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