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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 如何裂解细胞
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yuanalice

银虫 (小有名气)

[求助] 如何裂解细胞

我用CHO细胞表达蛋白，如何裂解细胞才能蛋白得率高，还不会是其他的细胞器类似溶酶体的膜破裂释放蛋白酶分解蛋白呢？请高手指点！
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1楼 2012-12-10 10:14:11
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yqbter: 金币+2, 鼓励老虫发帖！ 2012-12-10 12:53:26
裂解液中加点酶抑制剂？
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2楼2012-12-10 12:49:27
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢参与 2012-12-12 07:45:21
yuanalice: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-12-13 20:28:49
CHO一般都是分泌表达的吧。
机械方式破碎，得到的蛋白最完全，要在低温下操作，裂解液中加点EDTA，还有蛋白酶抑制剂。
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3楼2012-12-10 14:28:24
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yuanalice

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by dshlove at 2012-12-10 14:28:24
CHO一般都是分泌表达的吧。
机械方式破碎，得到的蛋白最完全，要在低温下操作，裂解液中加点EDTA，还有蛋白酶抑制剂。

我是用的别人构建的一个载体，本来应该分泌表达，可是不知为什么我的基因插进去以后就包内表达了呀！挺郁闷的呢
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4楼2012-12-11 11:46:38
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
yuanalice: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-12-13 20:29:15
引用回帖:
4楼: Originally posted by yuanalice at 2012-12-11 11:46:38
我是用的别人构建的一个载体，本来应该分泌表达，可是不知为什么我的基因插进去以后就包内表达了呀！挺郁闷的呢...

那你可以机械破碎，看看有没有活性。如果有的话倒也不妨，如果没有的话你就要找原因了。
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5楼2012-12-11 12:25:02
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zhen_fang

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2012-12-12 07:45:38
超声破碎是常用的方法，也可以酶裂解
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6楼2012-12-11 20:17:55
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yeyu541200

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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yuanalice: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-12-13 20:17:46
可以用PBS中加入1mM的EDTA，再加入蛋白酶抑制剂。这时你可以用-20冻融3次，也可以用超声波破碎，1s.3s.180次。但是如果你要用柱子提纯蛋白，要先看看要不要加EDTA，因为，有的柱子加了EDTA就挂不上柱子。具体情况你再看看吧 ！祝成功!!!!
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7楼2012-12-12 09:12:41
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wchuangqi

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
超声加蛋白酶抑制剂
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天道酬勤
8楼2012-12-12 15:49:52
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yuanalice

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhen_fang at 2012-12-11 20:17:55
超声破碎是常用的方法，也可以酶裂解

超声会使细胞内的其他膜结构也破裂，蛋白酶会释放，影响蛋白得率吧！
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9楼2012-12-13 20:30:34
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zhen_fang

银虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by yuanalice at 2012-12-13 20:30:34
超声会使细胞内的其他膜结构也破裂，蛋白酶会释放，影响蛋白得率吧！...

一般胞内蛋白都有一定的活性pH范围，改变buffer的pH可以很大程度上抑制蛋白酶活性
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10楼2012-12-14 12:19:46
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