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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 电化学 » 电化学传感器 » EDC/NHS活化金电极-硫醇后抗体固定不上
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onlycwt

铜虫 (小有名气)

[求助] EDC/NHS活化金电极-硫醇后抗体固定不上

最近在做生物传感器，按照如下步骤进行，但不知为什么抗体修饰不上去，请大侠帮我看看哪里有问题：
1、预处理金电极：化学抛光+电化学抛光
2、10毫摩 11-巯基十一烷酸乙醇溶液中避光浸泡3小时
3、75mM/15mM  EDC/NHS水溶液浸泡1小时
4、电极自然晾干后滴加20uL 0.5mg/ml BSA水溶液，封装好在37°下反应1小时或4°下12小时（暂时用便宜的BSA代替抗体，看能不能修饰上）
5、将电极轻轻浸入双蒸水1分钟，取出后测试
--------------------------------------------------------------------
不知道为什么就是不能修饰上去，EDC/NHS 活化那步电阻变小很多，跟文献相符，但不知带是否活化成功。

请帮忙看看哪里出了问题
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羧基活化EDC|DCC,NHS 金纳米棒及修饰 金电极 电化学

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莫听穿林打叶声，何妨吟啸且徐行。
1楼 2012-11-27 20:53:10
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onlycwt

铜虫 (小有名气)
另外，EDC/NHS溶液是混合在一起用还是分开，活化的时候需要现配吗？
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莫听穿林打叶声，何妨吟啸且徐行。
2楼2012-11-27 20:55:17
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onlycwt

铜虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by Jackcd12 at 2012-11-27 21:03:59
硫醇在Au表面的自组装方法虽已使用20年了，看似简单，但要获得满意的单分子膜却不是想象的那么容易。这个自组装过程中最关键的要素是保证Au表面的干净（无污染），其它的都很简单。因此，你如果是Au棒（不是Au薄膜） ...

做了实验，发现自组装3小时和自组装14小时的电阻几乎一样，所以采用3小时，怎样知道硫醇组装的好还是坏，电阻都是那么大。
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莫听穿林打叶声，何妨吟啸且徐行。
4楼2012-11-27 21:23:42
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onlycwt

铜虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by 天堂方向 at 2012-11-28 11:48:53
EDC/NHS活化了，电极自然晾干后滴加20uL 0.5mg/ml BSA水溶液

为什么要自然晾干，而不是氮气吹干？
觉得是这步出问题了。时间太久，EDC/NHS活化效果没有了，所以无法连接。

因为我怕用氮气吹就把电极表面的硫醇吹松了，测试的时候会掉，所以采用自然晾干。请问EDC/NHS活化后是会很快失活的吗？另外EDC/NHS溶液需要现配现用吗？
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莫听穿林打叶声，何妨吟啸且徐行。
7楼2012-11-28 20:51:58
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铜虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by 天堂方向 at 2012-11-29 10:09:28
一般EDC/NHS 不会存活很久，活化后最后马上进行实验，当然是现配的。
...

请问EDC/NHS溶液是否要用缓冲溶液控制pH值？pH多少好呢？
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莫听穿林打叶声，何妨吟啸且徐行。
9楼2012-11-29 14:21:50
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铜虫 (小有名气)
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10楼: Originally posted by sailorlanyu at 2012-11-30 10:42:46
不怕，氮气吹不会把硫醇吹坏。EDC/NHS是要现配的。然后体系下，处理金电极的时候，不要加热到80度在硫酸/双氧水中超声。我们实验室就弄废过电极。泡着超声就好，别加热...

请问EDC/NHS溶液直接用水配还是用缓冲溶液呢，pH是多少比较好啊？我看有人用0.1M MES pH 6缓冲溶液,昨天我试了PBS pH 6的缓冲溶液活化效果不好。
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莫听穿林打叶声，何妨吟啸且徐行。
11楼2012-11-30 11:24:15
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铜虫 (小有名气)
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12楼: Originally posted by 天堂方向 at 2012-12-02 20:07:44
需要用缓冲液。
至于pH用多少要看你的实验。
如果一般链接反应大家做的实验有两种，一种是一锅法，直接加入EDC/NHS，溶液中的带氨基和带羧基的化合物直接活化反应，这步要避免使用带氨基或羟基的缓冲液，一般pH在 ...

太感谢了，你一言顶我看好多文献总结。
我的是分两步反应的，先活化，再滴涂抗体。
请问第一步活化的缓冲剂有要求吗？用PBS，还是MES，还是盐酸-咪唑缓冲溶液？第二步修饰抗体使用的缓冲溶液是PBS吗？
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莫听穿林打叶声，何妨吟啸且徐行。
13楼2012-12-02 22:08:25
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铜虫 (小有名气)
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引用回帖:
12楼: Originally posted by 天堂方向 at 2012-12-02 20:07:44
需要用缓冲液。
至于pH用多少要看你的实验。
如果一般链接反应大家做的实验有两种，一种是一锅法，直接加入EDC/NHS，溶液中的带氨基和带羧基的化合物直接活化反应，这步要避免使用带氨基或羟基的缓冲液，一般pH在 ...

14楼2012-12-02 22:10:28
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铜虫 (小有名气)
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15楼: Originally posted by 天堂方向 at 2012-12-04 20:22:08
只要避免使用带氨基和羟基的。MES或1-甲基咪唑-HCl Buffer都可以。我用的后者。
第二步连接倒是感觉均可。用PBS或Tris-HCl都可以。
...

上次试了MES buffer不太行，请问咪唑缓冲溶液的浓度用多少呢？
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莫听穿林打叶声，何妨吟啸且徐行。
16楼2012-12-09 18:41:00
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15楼: Originally posted by 天堂方向 at 2012-12-04 20:22:08
只要避免使用带氨基和羟基的。MES或1-甲基咪唑-HCl Buffer都可以。我用的后者。
第二步连接倒是感觉均可。用PBS或Tris-HCl都可以。
...

对啦，这位大侠，是不是只能用1-甲基咪唑不能用咪唑配缓冲溶液呢？因为咪唑貌似带胺基。
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莫听穿林打叶声，何妨吟啸且徐行。
17楼2012-12-09 20:26:20
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