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轻清1106

铜虫 (小有名气)


[交流] 配制PCR反应体系在碎冰上好,还是经-80℃冰冻过的冰上好呢? 已有38人参与

近期将碎冰于前天放至-80℃冰箱,第二天取出用,省去等制冰机制冰的时间。在这个冰上配制PCR反应体系,有些药品会凝固。稀释的DNA最多用3-4天就会慢慢降解,P出来的结果越来越不理想。这是因为-80℃冰导致的么?各位有经验的都出来交流交流咯。。。
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zhanggz

银虫 (正式写手)

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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-05 20:11:06
一般的PCR反应,像现在的天气用不用冰都没有关系。Taq酶提取时需要在4度冰箱里透析了两天。不过在冰上心里感觉会好些,PCR体系不稳定还是从其他方面找原因,应该不是酶的问题。用-80的冰有点夸张了!
6楼2012-11-05 11:45:12
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ybQuan

金虫 (著名写手)


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告诉你大神怎么做:全程不用冰,效果照样很犀利。
关键不在用不用冰
哥在江湖漂,很少不挨刀,不是愿意挨,是哥很无奈!
13楼2012-11-05 17:32:26
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huanshi

银虫 (小有名气)


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随便做,习惯室温做,大夏天也是,关键引物要设计好!
16楼2012-11-05 18:34:24
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huanancy2012

银虫 (小有名气)


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用普通的碎冰即可,在加taq酶时尤其要注意,因为taq酶要避免反复冻融,平常taq酶是保存在-20度的,在取完酶后要及时将taq酶放回冰箱-20度层,同时加taq酶后的反应体系应在冰上,这样可以保证在pcr反应中过早出现非特异性的模板,造成在后续实验中出现非特异带。
淡定人生!
21楼2012-11-06 00:43:20
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普通回帖

静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)


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碎冰的好吧,其实没关系的啊
让复杂的事情变简单,简单的事情更简单
2楼2012-11-05 10:46:57
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

新鲜制的冰就可以了
jiayoubashaonian
3楼2012-11-05 11:20:01
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阿留申

铜虫 (初入文坛)

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-05 20:10:38
加酶之前放不放冰上都无所谓,加酶之后最好放在冰上,因为加了Taq酶(该酶在很大温度范围内都是有活性的),体系就会反应,可能会对我们扩增的片段有一定的影响。但是如果做得样比较少时,这些没太大影响,如果做得样多,不放冰上可能影响比较大!希望对你能有些帮助
4楼2012-11-05 11:24:54
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86964109

木虫 (小有名气)

★ ★
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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-11-05 20:10:51
-80 冻过的冰上放置试剂一般都会冻结的,尽量不要用,反正酶是不能冻存在-80的,容易变构失活,从-80刚拿出的冰基本上也是那种温度,一定要放冰上的话,还是用新鲜的碎冰或冻存在-20吧
5楼2012-11-05 11:41:21
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blackeye67

银虫 (初入文坛)


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细致点的都在冰盒上加,最后加酶一定要放在冰上,粗糙点的话除了酶之外都可以再室温配,最后加酶在冰上加。不用-80冰的,一般就可以了。
7楼2012-11-05 14:17:42
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riyuewangxiaoke

木虫 (著名写手)


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普通的冰块 碎了就行吧
当时明月在曾照彩云归
8楼2012-11-05 16:01:04
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lwllhb

至尊木虫 (著名写手)

其实没关系的啊
9楼2012-11-05 16:18:38
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geyuyang2010

铁虫 (小有名气)


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-20度即可,只是防止防止加样时发生酶促反应,温度到达一定程度即可
10楼2012-11-05 16:36:14
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