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sunhengfei

金虫 (小有名气)

[求助] 定点突变PCR结果求指导

第一次做定点突变的PCR，根据Phusion酶的说明书进行加样：13.6μL水+4μL HF buffer+0.8μL质粒模板+0.5/0.5μL正反向引物+0.4μL dNTPs+0.2μL酶；
程序是98℃ 1min，（98℃ 5s，60℃ 15s，72℃ 2min30s）x25，72℃ 10min，10℃保存。
下图为琼脂糖电泳图，1道为MarkerIII，2、3道为平行实验。
请问应该如何摸索条件？

user 2012-09-12 12 小时 49 分钟_副本.jpg
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1楼 2012-09-13 10:58:15
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sunhengfei: 金币+20, ★有帮助 2012-09-19 21:03:19
根据楼至的延伸时间推断你的目的片段应该在4KB，没有目的条带，这种原因的话 首先可以降低一下退火温度，改为55度，其次换一下酶，Phusion酶保真性高，但是有时候条带就是扩不出来，具体还需要LZ说下条带，TAKAKA 的 LA保真性也是不错了，可以试一下
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2楼2012-09-13 18:47:26
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sunhengfei

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无疆@行者 at 2012-09-13 18:47:26
根据楼至的延伸时间推断你的目的片段应该在4KB，没有目的条带，这种原因的话 首先可以降低一下退火温度，改为55度，其次换一下酶，Phusion酶保真性高，但是有时候条带就是扩不出来，具体还需要LZ说下条带，TAKAKA 的 ...

果然是试剂的问题 借用别的实验室Phusion酶试剂盒就成功了 谢谢您了！
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3楼2012-09-19 21:02:30
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