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zlyshandon

木虫 (正式写手)

[求助] 双向电泳总是有条纹。

如图,总是有条纹在,丙酮(-20沉淀两小时),TCA(15%)沉淀都会有这个问题,一向在升压过程 中没有什么问题,电流也不会太大。是霉菌的胞内蛋白,沉淀后的蛋白浓度大概是2.5mg/ml的样子。
1、24cm的胶条多少的上样量合适?我上的是600微克。
2、样品处理为先1:1的湿菌体和玻璃珠混合后液氮研磨,再用minibeads beater间歇破碎10min(30s破碎30s冰浴)。离心后取上清沉淀。染色是胶体考染。第一次做的时候染色完成后蛋白点比较清晰,但是用超纯水脱色后就变成了条带状,不知道是为什么?有人遇到过这种情况吗?
做了好久了都是有条纹,希望哪位大侠给指导下,可以追加金币的,只要能把问题解决了。谢谢!

1.jpg
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DBWJ

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zlyshandon: 金币+5, 谢谢 2013-05-21 15:46:00
感觉你的胶图上的点聚焦不是特别好啊,上样量可以用800或1000μg,如果你的是pH3-10线性的,可以换成pH4-7线性的看看,因为你的点集中在比较中间,可以用窄范围的看看。聚焦时间可以延长一下,那个条带我也经常出现,也不知道什么原因,我出现的一般在碱性端
5楼2013-05-21 09:13:20
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zlyshandon

木虫 (正式写手)

3、蛋白好像都是比较小的蛋白,大分子量蛋白比较少,这是怎么回事呢?
2楼2012-09-10 10:08:29
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yudongzhai

金虫 (正式写手)

钻石虫

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我觉得应该不是染色脱色的问题,因为我用双向电泳后的胶去做过WB,WB后的膜上也会有那样的条纹
我思故我在
3楼2012-09-10 12:14:38
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lanziliuli

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-11 15:59:13
首先你24cm的胶条PH是多少,你上样量有点少了,感觉蛋白点不是很多,ph3-10上样1000ug左右,PH4-7上样1500ug左右。蛋白都集中在小分子区域,像是蛋白发生降解了,胶的背景也比较深,杂志没去除干净。条纹可能是核酸等杂质引起的
做好科研
4楼2012-09-11 14:16:17
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