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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 同一次PCR平行样结果不一样~有图有真相~求各位大神指教~~小女子万分感谢~
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mooze

金虫 (正式写手)

[求助] 同一次PCR平行样结果不一样~有图有真相~求各位大神指教~~小女子万分感谢~

之前能扩出来的基因A，现在扩的结果乱七八糟（前四个为基因A）：
模板名称                        a    b   c    d    b（基因B作为对照）
体系加入0.5ul模板         -     -    -    -     +
体系加入1ul模板            -     -    +   -     -

abcd四个模板均含A和B两个基因（之前扩出来过），前段时间A突然扩不出来了，就重新稀释了下引物，基因B作为对照（两个的退火温度基本一致）。
现在出来的结果让我感觉很不可信，同一次扩PCR，两个平行样的结果都不一样。不知道究竟问题出在哪儿，求各位大神指教。

2012-8-28-2(1).JPG

[ Last edited by mooze on 2012-8-28 at 16:51 ]
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1楼 2012-08-28 16:28:05
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-08-28 19:39:17
你的A B两个基因大小是多少，还有你的整体PCR体系是什么，模板量0.5不少吗？还是你的模板本身浓度特别高？你的引物确定有没有混在一起？
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生物化学与分子生物学
2楼2012-08-28 17:24:54
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mooze

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lidonghong at 2012-08-28 17:24:54
你的A B两个基因大小是多少，还有你的整体PCR体系是什么，模板量0.5不少吗？还是你的模板本身浓度特别高？你的引物确定有没有混在一起？

A基因750，B基因400。20ul体系（10ultaq酶）。试剂盒提取的DNA基因组，之前都是一直加0.5ul。引物确定没有混在一起。
现在是：B基因，同时加模板0.5跟1uL的。0.5uL的出来带了，1uL的没带。A基因（另外一个），模板c加1ul的出来了，0.5uL的没出带。
郁闷中。谢谢~
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3楼2012-08-28 17:29:40
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-29 16:24:18
你的taq酶用了10ul这么多啊，你的反应体系是你自己设计的还是参照哪上面的？你买的扩增酶上面应该是推荐使用的体系和反应条件啊，你是否是按照上面的条件进行的？
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生物化学与分子生物学
4楼2012-08-28 23:00:16
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by mooze at 2012-08-28 17:29:40
A基因750，B基因400。20ul体系（10ultaq酶）。试剂盒提取的DNA基因组，之前都是一直加0.5ul。引物确定没有混在一起。
现在是：B基因，同时加模板0.5跟1uL的。0.5uL的出来带了，1uL的没带。A基因（另外一个），模板 ...

用10uL的酶？我的乖乖，我们50uL体系都只要0.5uL的。
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5楼2012-08-28 23:55:18
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