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mooze

金虫 (正式写手)

[求助] 同一次PCR平行样结果不一样~有图有真相~求各位大神指教~~小女子万分感谢~

之前能扩出来的基因A,现在扩的结果乱七八糟(前四个为基因A):
模板名称                        a    b   c    d    b(基因B作为对照)
体系加入0.5ul模板         -     -    -    -     +
体系加入1ul模板            -     -    +   -     -

abcd四个模板均含A和B两个基因(之前扩出来过),前段时间A突然扩不出来了,就重新稀释了下引物,基因B作为对照(两个的退火温度基本一致)。
现在出来的结果让我感觉很不可信,同一次扩PCR,两个平行样的结果都不一样。不知道究竟问题出在哪儿,求各位大神指教。

2012-8-28-2(1).JPG

[ Last edited by mooze on 2012-8-28 at 16:51 ]
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mooze

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lidonghong at 2012-08-28 17:24:54
你的A B两个基因大小是多少,还有你的整体PCR体系是什么,模板量0.5不少吗?还是你的模板本身浓度特别高?你的引物确定有没有混在一起?

A基因750,B基因400。20ul体系(10ultaq酶)。试剂盒提取的DNA基因组,之前都是一直加0.5ul。引物确定没有混在一起。
现在是:B基因,同时加模板0.5跟1uL的。0.5uL的出来带了,1uL的没带。A基因(另外一个),模板c加1ul的出来了,0.5uL的没出带。
郁闷中。谢谢~
3楼2012-08-28 17:29:40
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查看全部 5 个回答

lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-08-28 19:39:17
你的A B两个基因大小是多少,还有你的整体PCR体系是什么,模板量0.5不少吗?还是你的模板本身浓度特别高?你的引物确定有没有混在一起?
生物化学与分子生物学
2楼2012-08-28 17:24:54
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-29 16:24:18
你的taq酶用了10ul这么多啊,你的反应体系是你自己设计的还是参照哪上面的?你买的扩增酶上面应该是推荐使用的体系和反应条件啊,你是否是按照上面的条件进行的?
生物化学与分子生物学
4楼2012-08-28 23:00:16
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by mooze at 2012-08-28 17:29:40
A基因750,B基因400。20ul体系(10ultaq酶)。试剂盒提取的DNA基因组,之前都是一直加0.5ul。引物确定没有混在一起。
现在是:B基因,同时加模板0.5跟1uL的。0.5uL的出来带了,1uL的没带。A基因(另外一个),模板 ...

用10uL的酶?我的乖乖,我们50uL体系都只要0.5uL的。
5楼2012-08-28 23:55:18
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