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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 急求！！！胰蛋白酶水解鱼精蛋白的方法！！！
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雅鱼cc

银虫 (小有名气)

[求助] 急求！！！胰蛋白酶水解鱼精蛋白的方法！！！

本人做分子荧光探针，现为检测鱼精蛋白（protamine sulfate salt from salmom),需要水解鱼精蛋白，鱼精蛋白的主要成分（66%）为精氨酸，所以选择用胰蛋白酶水解。实验条件为PH=8.5，T=25°，溶剂为PBS（20mM),并添加了钙离子，可是总是不水解.....求助，怎样配胰蛋白酶溶液？国产胰蛋白酶好吗？为什么不水解呢？？？
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雅鱼cc

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cherry
1楼2012-08-23 11:22:52
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雅鱼cc

银虫 (小有名气)
★
送鲜花一朵
wizardfan: 金币+1, 可以重开新帖求助 2012-09-06 05:55:15
谢谢您，那我就以送鲜花的方式给您金币吧。另外，您会用oringin作图吗？我最近在做紫外吸收的实验，因为想要得到酶水解蛋白过程所有使用模式是time scan,也就是固定一个波长，检测其在一个时间段的吸光度,做好后我不会用紫外作图.......，请问您会吗？
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cherry
5楼2012-09-05 23:53:55
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ottolzm

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
wizardfan: 金币+5, 回答充满了智慧，赞 2012-08-25 03:23:24
几个问题：
1.鱼精蛋白66%为精氨酸，虽然精氨酸是可以被胰蛋白酶特异性识别和降解的，但是这个只是相对的，并且作用在其羧基端，你是不是可以再分析分析鱼精蛋白的成分和特性；
2.动物来源的胰蛋白酶需要钙离子，也可以不需要，pH可以选择pH8.0即可，温度升高到37℃，将缓冲液换成20mMTris-HCL，并添加50mM Ca离子试试；
3.国产的胰酶品质不均一，可以选择进一步纯化过的，上海生工的胰蛋白酶粉末就不错，25g不到200RMB。
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2楼2012-08-24 19:48:10
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雅鱼cc

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
wizardfan: 金币-5, 代给金币 2012-09-04 04:19:54
引用回帖:
2楼: Originally posted by ottolzm at 2012-08-24 19:48:10
几个问题：
1.鱼精蛋白66%为精氨酸，虽然精氨酸是可以被胰蛋白酶特异性识别和降解的，但是这个只是相对的，并且作用在其羧基端，你是不是可以再分析分析鱼精蛋白的成分和特性；
2.动物来源的胰蛋白酶需要钙离子， ...

谢谢您的指导，一直忙做实验，没有给你回复，那个金币怎样给您呢？我第一次发帖，不是很了解。请您z再指导下。Ps:胰蛋白酶为什么可以加钙离子也可以不加呢？我的导师问我，我回答不出来.......
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cherry
3楼2012-09-03 20:30:33
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ottolzm

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
wizardfan: 金币+10, 非常详细的回答，值得鼓励（5），另代楼主发金币（5） 2012-09-04 04:19:21
引用回帖:
3楼: Originally posted by 雅鱼cc at 2012-09-03 20:30:33
谢谢您的指导，一直忙做实验，没有给你回复，那个金币怎样给您呢？我第一次发帖，不是很了解。请您z再指导下。Ps:胰蛋白酶为什么可以加钙离子也可以不加呢？我的导师问我，我回答不出来..........

呵呵 金币不金币的不要紧 关键在交流 正好做了点这方面的工作 给你说说 为什么钙离子可加可不加 囵吞的讲 钙离子是胰蛋白酶的激活剂 对于不同来源的胰蛋白酶的激活作用有所差异 从机理上讲 钙离子的加入会致使胰蛋白酶分子内部的盐离子键作用更加强烈，胰蛋白酶的两个β折叠形成的疏水孔结构域更加稳固 致使整体的Asp102,His57,Ser195,催化三联体和Asp189,Gly216,Gly226所形成的底物结合口袋结构更加稳固，二者相互协同的效率更加高效，从而使局部的酶催化效率提高，所以在相关的酶学性质试验中，总能得到，添加钙离子得到的酶活要稍高于不加钙离子的酶活，但是从我了解到你的实验和实验目的来看，这点并不会对你的实验产生影响，应为添加钙离子也不会造成多高的酶活的提高，而你的目的只是要求胰蛋白酶能降解你的蛋白质，至于活力的定量的高低，并没有多大作用，所以对此大可不必太多纠结，通过我用胰蛋白酶水解哺乳动物细胞的实验，这点可以得到很好地证明，加于不加钙离子，并没有本质上的区别，可能只是在时间上的差别，加了钙离子的催化的快一些，不加钙离子的催化的相对慢一些，实验发现这两者是前者5分钟完全水解好，后者可能需要延迟2-3分钟；不知道这样说是否能够解答你的疑惑。
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4楼2012-09-03 23:04:21
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