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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 农杆菌菌液pcr实验过程
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曾经遥远

银虫 (正式写手)

[求助] 农杆菌菌液pcr实验过程

准备做转基因，从别人那里得到了农杆菌单克隆，然后需要做菌液pcr检测一下是否有目的基因。可是偶之前都没接触过这些分子的东西，不懂怎么做。查到的文献又都没有具体的实验步骤，又木有人指导。可怜的娃，现在头可大了。有这方面经验的虫虫还请指导一下，或者有相关书籍、文献帮个忙推荐一下，在此谢过了！！
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1楼 2012-08-10 17:35:14
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zhqu1234

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
曾经遥远: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-08-10 20:12:09
额，其实很简单啊，通俗一点说就是：农杆菌28度24h摇好后，配PCR体系，然后拿个枪头沾一下菌液戳进体系里晃晃，然后PCR就行了
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2楼2012-08-10 17:58:59
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第五平原

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
曾经遥远: 金币+1, ★有帮助, 嗯嗯 偶再找找看 2012-08-10 20:13:08
楼上说得对，其实和普通PCR一样，楼主要是实在不明白就去找一些学位论文，那里面讲的很详细。
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勤勉
3楼2012-08-10 18:54:20
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lillian菲

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
曾经遥远: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢哈 2012-08-10 20:14:07
我们实验室做的是嗜盐菌，也是PCR之后再做酶连，转化，提质粒，测序。
具体是：先平板培养出单菌落----挑取单菌落试管液体培养---用适量菌液离心留菌体（即沉淀），再加入无菌水，混匀----沸水煮10分钟，取上清液做模板
接下来就是按照PCR正常体系做PCR即可。
不知是不是一样，希望能帮到你吧！
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4楼2012-08-10 19:56:57
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曾经遥远

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhqu1234 at 2012-08-10 17:58:59
额，其实很简单啊，通俗一点说就是：农杆菌28度24h摇好后，配PCR体系，然后拿个枪头沾一下菌液戳进体系里晃晃，然后PCR就行了

摇好后需要离心吗？需要先煮让细胞裂解吗？偶主要是细节上不太懂。麻烦指教！
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5楼2012-08-10 20:11:37
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曾经遥远

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lillian菲 at 2012-08-10 19:56:57
我们实验室做的是嗜盐菌，也是PCR之后再做酶连，转化，提质粒，测序。
具体是：先平板培养出单菌落----挑取单菌落试管液体培养---用适量菌液离心留菌体（即沉淀），再加入无菌水，混匀----沸水煮10分钟，取上清液做 ...

菌落大概培养多久?只要看到浑浊吗？
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6楼2012-08-10 20:15:12
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tiani_tan

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
曾经遥远: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢哈 2012-08-10 22:13:36
平板上的农杆菌挑菌后大概培养24h就比较浑浊了。做菌液PCR只要有菌就行，和常规的PCR体系一样。不用对菌液进行预处理，PCR反应体系中94度变性已经将细胞裂解了
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7楼2012-08-10 20:22:57
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曾经遥远

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by tiani_tan at 2012-08-10 20:22:57
平板上的农杆菌挑菌后大概培养24h就比较浑浊了。做菌液PCR只要有菌就行，和常规的PCR体系一样。不用对菌液进行预处理，PCR反应体系中94度变性已经将细胞裂解了

那后面的跑胶中marker用什么做呢？我需要的目的基因是1231bp和1079bp等。pcr偶也不熟，偶连菜鸟级还没达到
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8楼2012-08-10 22:22:28
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tiani_tan

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

marker用2000bp的就行，实验都是由菜鸟慢慢变为老鸟的，祝好运！！
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9楼2012-08-11 08:22:27
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曾经遥远

银虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by tiani_tan at 2012-08-11 08:22:27
marker用2000bp的就行，实验都是由菜鸟慢慢变为老鸟的，祝好运！！

噢噢，呵呵，谢谢了哈
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10楼2012-08-11 10:53:45
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