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硫酸铵沉淀的一些问题，求高手帮忙看一下！
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最近在做一种真菌胞外酶的分离，不知道蛋白的具体的性质，文献报道的种类也比较多。不过大部分都采用硫酸铵沉淀后，再过柱子。 我选择加入固体硫酸铵（考虑到发酵液大量，加入液体体积太大了），发酵液离心去沉淀，滤纸抽滤3次，加入EDTA（终浓度为1mM），发酵液的蛋白含量在10ug/ml左右，做80%的硫酸铵沉淀，全程操作在冰水上进行。 在《蛋白技术手册》中，提及加入硫酸铵的时间再10-20min之内，但是又强调必须等硫酸铵晶体溶解完之后加。我640ml的发酵液，尽量保证溶解之后再加，总共用了四个小时才加完。 之前的预实验，严格保证硫酸铵溶解完之后加，总共用了四天时间（每天加10个多小时）。 两次的实验结果相差不大，复性之后都损失了将近95%的蛋白，比酶活也下降非常多。在加入硫酸铵的过程中，花费四小时的实验，出现了大量的白色泡沫（蛋白变性的结果），花费四天的实验中泡沫则要少一些。两次实验中，收集沉淀，混溶然后离心，有一半都是不溶固体（在加入硫酸铵后，有大量的絮状沉淀出现，应该是这些物质）。 有这样几个问题 1：不知道硫酸铵的加入时间以及加入速度，到底是怎么样的？有过相关经验的同学能不能给个参考~~~（这实验一直失败，关于这个问题各种凌乱...） 2：硫酸铵沉淀这种方法对于蛋白浓度要求最好是1mg/ml，但是我发酵液蛋白浓度本来就极低，原来就想通过硫酸铵沉淀得到浓缩液的，实验失败是不是与我浓度低有关？ PS：也想过其它的方法，譬如聚乙二醇吸水（我将近1L的发酵液，所用的量实在太大了...），超滤没有相关设备，原核表达的话，估计又要做个半年一年的了。实验卡这里超过两个月了，各种纠结啊~~ [ Last edited by cc1000ml on 2012-8-10 at 11:42 ] |
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 【分子生物】EPI帖 | 蛋白表达纯化鉴定精华 |
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8楼2012-08-11 09:21:56
dshlove
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我觉得你的操作太费时间了。 其实，640ml的体积对生产来说已经很小了，所以，我的建议是先将硫酸铵配置成饱和溶液，然后算好要加的体积量，用蠕动泵滴加。同时用小转子搅拌，速度要慢。这样就能得到比较均一的乳状悬浊液。不会出现你说的絮状沉淀还有泡沫了，再离心取沉淀。再做下一步处理。 固体硫酸铵加入到发酵液你还要不断搅拌，会产生很多泡沫，蛋白变性就无法避免了，而且，固体会导致局部浓度过高，形成絮状沉淀。配置饱和溶液就能解决了。 |
2楼2012-08-10 14:16:18
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几点疑问 1：如果按照640ml的发酵液，到80%浓度，需要硫酸铵饱和溶液将近500ml，体积几乎是翻倍了。如果加入500ml饱和溶液，那么滴加速度该如何控制呢？（如果加入固体会有明显晶体可以看得到，可以作为一个快慢标准.） 2：再者是一个过程总共需要多少时间的问题，因为那个手册中明确说明要在10-30min内加完，所以我个人觉得加硫酸铵的时间应该是一个比较重要的因素.不知道您是怎样看这个问题的。 3：关于絮状沉淀和泡沫的问题。 我在加入过程中也是使用磁力搅拌机，，气泡之所以很多而且聚集的原因主要是蛋白变性，使溶液粘度增加，搅拌产生的气泡难以破碎。气泡应该是蛋白变性的一个表现。 絮状沉淀是在加完硫酸铵之后，静止一小时后可以看得到的，在刚加完的时候也是一种比较均一的悬浊液。 十分感谢您的回复~~~ |
3楼2012-08-10 15:40:28
dshlove
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针对你的问题，我就自己知道的回答下： 1：滴加的速度基本就是一秒一到两滴的速度，当然你可以按照蛋白的要求，在某一规定时间内全部加进去。 2：其实手册说明只是一个大概的，一般蛋白55%情况下就能沉淀差不多了，85%能获得最大量，所以你要结合你的蛋白，在不产生局部沉淀情况下尽量快。但是，我觉得加的时间不是一个特别重要的因素，我觉得浓度才是比较重要的，毕竟沉淀过程其实也是一个去杂和富集的过程。 3：产生气泡，说明你搅拌得太剧烈了。搅拌必须是有规则和温和的。粘度增加可能不是蛋白的原因，也有可能是核酸太多了。气泡有时候可以在样品里补点NaCl，可以消泡的。 加完硫酸铵之后为什么要静置啊？可以用转子低转速搅拌半个小时再去离心。 |
4楼2012-08-10 16:34:02
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