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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 最近做T克隆都是阴性，怎么回事？
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sxxuan

金虫 (著名写手)

[求助] 最近做T克隆都是阴性，怎么回事？

一直做T克隆都觉得效率不高，但每次都能拿到阳性的重组菌就没有多想怎么去改善，但是最近出了很大的问题，都是阴性，或者鉴定时候有很多非特异性条带，送测序之后测序公司告知两次摇菌都不成功，测序失败。
1.PCR产物不是我做的，但是每次克隆前都会先跑胶确认条带。
2.纯化都选用生工的试剂盒
3.载体都是pMD18-T，有时候用附带的solutionI,有时候用NEB的T4连接酶
4.最普通的转化方法，冰浴30min，42℃90s，冰上3min，加入LB后培养1h后6000rpm离心3min，取出多余的LB，一般剩100ml，重悬后涂板。
5.感受态都是用0.1M CaCl2制备的，JM109，OD600=0.4~0.45，100ml菌液最后用5mlCaCl2重悬，加入1ml甘油混匀，100ul分装。-80保存

大概的步骤就是这样，但转化长出来的菌落都不多，30来个是正常，好一点就五六十个，请问是感受态效率不高，还是连接效率不高？还是都 不高？可以怎么改善呢？请大家提出宝贵的意见或说说自己是怎么做的也好，谢谢！
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你的日子如何，你的力量也必如何！
1楼 2012-07-27 20:11:46
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jackiey2 at 2012-07-28 13:37:34
建议买商品感受态细胞试试，转化效率说明书上说能达到95%，某用过，大量长菌，价格也不贵。

哪个厂家？价格如何？我的用量比较大，一个月一百多个。
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你的日子如何，你的力量也必如何！
9楼2012-07-28 22:53:07
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robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sxxuan: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-07-28 12:22:38
可以用载体试剂盒所带的DNA片段链接载体以及一个较大的质粒分别转化，做个对照。转化质粒如果不经离心，取30微升即能长出大量单菌落，说明感受态没有问题，如果对照长出单菌正常，说明链接没有问题。PCR产物要确认是末端带A，胶回收温度不宜过高（最好不要超过70度），时间不宜过久。用过的连接酶用，感觉MBI的T4 DNA ligse，16度过夜链接效果不错。还要确认感受态无杂菌污染。
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2楼2012-07-27 21:01:53
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scutphoenix

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
TA克隆不用蓝白斑吗？
个人认为，菌落少说明感受态不行，转化率低；或者T载不行了，没多少有用的；也可能是PCR产物不行，因此出来的都是自连的T载，也就都是蓝斑。
其他的原因不清楚了，赶时间的话买新的，不赶时间的话，每个步骤设对照验证下。
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3楼2012-07-28 00:31:14
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR产物是否带A尾巴？PCR产物直接试剂盒纯化不如胶回收纯化的好，实在不行，就改用胶回收。纯化后浓度偏低的话，加核酸沉淀剂乙醇沉淀溶解于小体积水中提高浓度。蓝白筛选辅助。
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为什么
4楼2012-07-28 01:39:45
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