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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 酵母菌中酶的分离提取
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zjutboss

银虫 (小有名气)

[求助] 酵母菌中酶的分离提取

筛选得到一株酵母菌，打算从中提取一种羰基还原酶。通过高压匀浆破碎，离心，得到的上清液中无酶活，而细胞碎片中却有酶活。通过镜检得知细胞已有效破碎。请教给位高手：
（1）目的蛋白是否为膜结合蛋白；
（2）怎样从细胞碎片中提取目的蛋白。
请给位做酶分离纯化的高手不吝赐教！小弟万分感谢！
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1楼 2012-07-24 11:01:28
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zjutboss

银虫 (小有名气)
求指导啊，不胜感谢！
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2楼2012-07-24 15:40:00
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zjutboss: 金币+3, ★有帮助, 这个是不是很贵，我看了产品介绍，可用50次，一次只能处理10的7次方个细胞！ 2012-07-25 13:51:55
是否是膜蛋白我觉得仅仅根据你的描述是不能确定的，还需要做一些证明。而对于膜蛋白的提取可以试试Thermo Scientific Mem-PER真核细胞膜蛋白抽提试剂盒，有朋友说用过。
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3楼2012-07-24 16:06:25
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
scelab: 金币+3, MicEPI+1, 不错的建议 2012-07-24 16:40:46
zjutboss: 金币+5, ★有帮助 2012-07-25 13:50:08
关于膜蛋白的证明，我了解的有一下几个方法：
1.膜蛋白跨膜区复含疏水氨基酸，所以可以测序后大致判断。一般可以看到疏水－亲水氨基酸的间隔排列，10个左右的氨基酸可以构成跨膜区。

2.荧光标记，GFP当然是一个不错的办法，

3.制备抗体，分离原来物种的膜蛋白，然后电泳，western。

我觉得第3条是比较适合你的。个人见解，仅供参考。
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4楼2012-07-24 16:15:27
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zjutboss: 金币+3, ★有帮助, 我也这样认为，谢谢！ 2012-07-25 13:52:47
引用回帖:
4楼: Originally posted by reallpf at 2012-07-24 16:15:27
关于膜蛋白的证明，我了解的有一下几个方法：
1.膜蛋白跨膜区复含疏水氨基酸，所以可以测序后大致判断。一般可以看到疏水－亲水氨基酸的间隔排列，10个左右的氨基酸可以构成跨膜区。

2.荧光标记，GFP当然是一个 ...

你的3个建议都建立在蛋白质已经纯化并且得到氨基酸序列的基础上，不符合楼主情况。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2012-07-24 18:36:30
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
zjutboss: 金币+1, ★有帮助 2012-07-25 13:57:10
引用回帖:
5楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-07-24 18:36:30
你的3个建议都建立在蛋白质已经纯化并且得到氨基酸序列的基础上，不符合楼主情况。...

谢谢指导，不胜感激！那在未知序列的情况下该如何入手呢？如果单纯的对于证明是否是膜蛋白，只有着力于纯化分离吗？像楼主这种情况，只有测序途径吗？
如果做质谱是否可以呢？
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6楼2012-07-24 18:56:42
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xhjggl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zjutboss: 金币+1, ★有帮助 2012-07-25 13:57:17
可以使用一步法酵母活性蛋白提取试剂盒试一下
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7楼2012-07-24 20:57:48
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zjutboss

银虫 (小有名气)
我的最终目的是得到纯化的羰基还原酶蛋白，使用试剂盒只能得到少量混合蛋白，所以不适用于后续的分离纯化。求一个经济实用的能大量提取蛋白的方法！
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8楼2012-07-25 14:00:54
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zjutboss

银虫 (小有名气)
谢谢各位的支持！
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9楼2012-07-25 14:01:06
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啊这是什么

新虫 (初入文坛)
请问解决了吗？

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10楼2019-03-19 17:46:54
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