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lishenchi

新虫 (初入文坛)

[求助] 构质粒P基因全长的时候用逆转录的模板P不出来,可以提DNA来P吗??

各位前辈,已知这个基因是有表达的,但是提RNA,逆转录成cDNA,以此为模板P基因,怎么也P不出来,引物啊条件啊,换过N多了,就是没有。

所以想是不是RNA逆转录的时候,片段丢失了或者断了

可以提DNA来P吗????看到提DNA的方法很多,请问具体用什么方法???

谢谢各位。
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-20 13:42:57
你提取的rna有没有跑胶鉴定过,如果鉴定是很好地三条带,之后你反转录为cdna后,做一个gapdh或者b-actin的对照,再做一个你目的基因的对照(就是你已经p出来的目的片段的模板),如果二者结果都很好,而你的目的片段没有出来,那么可能是你的目的基因的表达量很低。一步一个脚印吧,不急。
关于你说的提取dna作为模板,不建议,因为你的rna反转录的cdna还没有出来,不知道表达的情况怎么样。所以还是优化你的pcr条件。
coasttocoast。
2楼2012-07-18 22:24:05
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lishenchi

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-18 22:24:05
你提取的rna有没有跑胶鉴定过,如果鉴定是很好地三条带,之后你反转录为cdna后,做一个gapdh或者b-actin的对照,再做一个你目的基因的对照(就是你已经p出来的目的片段的模板),如果二者结果都很好,而你的目的片段 ...

你好,谢谢您的回复,用cDNA做过GAPDH,但是不知道出来的100多的片段是GAPDH还是引物二聚体。请问怎么区别啊?只有一条带
3楼2012-07-19 18:17:56
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by lishenchi at 2012-07-19 18:17:56
你好,谢谢您的回复,用cDNA做过GAPDH,但是不知道出来的100多的片段是GAPDH还是引物二聚体。请问怎么区别啊?只有一条带...

引物二聚体很小的呀,不可能超过100bp的。要区分的话,可以只加引物,跑出来的二聚体和GAPDH做个比较就可以了。
coasttocoast。
4楼2012-07-19 20:21:43
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nmhsd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流,多多应助 2012-07-20 13:43:12
1考虑你的载体类型,是否容易重组丢失和例如核酸酶突变型DH5a一般是不会丢失质粒的。如果确实如你所说,那就只能通过实验验证了。“已知这个基因是有表达的”如何知道的,有抗性标记基因吗?如果产生重组,这个抗性说明不了你的目的基因也同时表达了。
2 提RNA,做RT-PCR,提DNA做PCR,比较。DNA提取,随便找本实验操作的书,照搬做即可,酒精要晾干些,不要残留即可。DNA也可以不提,直接菌液PCR即可。
5楼2012-07-19 22:50:28
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lishenchi

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by nmhsd at 2012-07-19 22:50:28
1考虑你的载体类型,是否容易重组丢失和例如核酸酶突变型DH5a一般是不会丢失质粒的。如果确实如你所说,那就只能通过实验验证了。“已知这个基因是有表达的”如何知道的,有抗性标记基因吗?如果产生重组,这个抗性 ...

你好,谢谢你的指导。。我的mRNA是细胞里提的。目前还没有这个基因的质粒啊。。。。
6楼2012-07-20 08:55:37
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