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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构质粒P基因全长的时候用逆转录的模板P不出来，可以提DNA来P吗？？
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lishenchi

新虫 (初入文坛)

[求助] 构质粒P基因全长的时候用逆转录的模板P不出来，可以提DNA来P吗？？

各位前辈，已知这个基因是有表达的，但是提RNA,逆转录成cDNA,以此为模板P基因，怎么也P不出来，引物啊条件啊，换过N多了，就是没有。

所以想是不是RNA逆转录的时候，片段丢失了或者断了

可以提DNA来P吗？？？？看到提DNA的方法很多，请问具体用什么方法？？？

谢谢各位。
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1楼 2012-07-18 19:55:48
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nmhsd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流，多多应助 2012-07-20 13:43:12
1考虑你的载体类型，是否容易重组丢失和例如核酸酶突变型DH5a一般是不会丢失质粒的。如果确实如你所说，那就只能通过实验验证了。“已知这个基因是有表达的”如何知道的，有抗性标记基因吗？如果产生重组，这个抗性说明不了你的目的基因也同时表达了。
2 提RNA，做RT-PCR，提DNA做PCR，比较。DNA提取，随便找本实验操作的书，照搬做即可，酒精要晾干些，不要残留即可。DNA也可以不提，直接菌液PCR即可。
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5楼2012-07-19 22:50:28
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-20 13:42:57
你提取的rna有没有跑胶鉴定过，如果鉴定是很好地三条带，之后你反转录为cdna后，做一个gapdh或者b-actin的对照，再做一个你目的基因的对照（就是你已经p出来的目的片段的模板），如果二者结果都很好，而你的目的片段没有出来，那么可能是你的目的基因的表达量很低。一步一个脚印吧，不急。
关于你说的提取dna作为模板，不建议，因为你的rna反转录的cdna还没有出来，不知道表达的情况怎么样。所以还是优化你的pcr条件。
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coasttocoast。
2楼2012-07-18 22:24:05
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lishenchi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-18 22:24:05
你提取的rna有没有跑胶鉴定过，如果鉴定是很好地三条带，之后你反转录为cdna后，做一个gapdh或者b-actin的对照，再做一个你目的基因的对照（就是你已经p出来的目的片段的模板），如果二者结果都很好，而你的目的片段 ...

你好，谢谢您的回复，用cDNA做过GAPDH，但是不知道出来的100多的片段是GAPDH还是引物二聚体。请问怎么区别啊?只有一条带
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3楼2012-07-19 18:17:56
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by lishenchi at 2012-07-19 18:17:56
你好，谢谢您的回复，用cDNA做过GAPDH，但是不知道出来的100多的片段是GAPDH还是引物二聚体。请问怎么区别啊?只有一条带...

引物二聚体很小的呀，不可能超过100bp的。要区分的话，可以只加引物，跑出来的二聚体和GAPDH做个比较就可以了。
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coasttocoast。
4楼2012-07-19 20:21:43
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