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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因克隆
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 基因克隆

我设计的一对引物，第一次PCR扩增时，发现扩增出来了片段，但个人感觉条带太暗，怕回收不回来，就扔了。第二次做，同样的体系，同样的条件，P出来，连一条条带都没有。而且第一次的让师兄看了，一点都不暗，说是能回收回来的。

请问各位，这是什么原因呢？为什么同样的条件，同样的体系，就是做不出来呢。
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nothing isimpossible
1楼 2012-07-03 00:39:16
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-03 15:31:22
hraikeyan: 金币+2 2012-07-25 11:20:09
1：第一次P出了条带，请问是就目的条带一条呢，还是有多条条带，如果多条说明引物的特异性不是很好，需要摸条件，如果第一次就P出了一条且是目的条带的话，只是有点暗的话，可以试着加大模板量，增加PCR循环数.
2：最好对模板进行检测，看看是否污染或者浓度是否足够，酶，引物，buff，水之类的东西也得确保没有污染，这些都会不经意中影响PCR，可以一一排除.
祝楼主好运
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
2楼2012-07-03 10:20:26
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Marado at 2012-07-03 10:20:26
1：第一次P出了条带，请问是就目的条带一条呢，还是有多条条带，如果多条说明引物的特异性不是很好，需要摸条件，如果第一次就P出了一条且是目的条带的话，只是有点暗的话，可以试着加大模板量，增加PCR循环数.
2： ...

请问模板怎么检测？是要做电泳吗？
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nothing isimpossible
3楼2012-07-03 12:22:42
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-07-03 12:22:42
请问模板怎么检测？是要做电泳吗？...

可以做个电泳看一下模板是否被污染，然后DNA浓度可以用分光光度计测量A260/280，如果在1.7-2.0之间，DNA可被认为是比较纯的.
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
4楼2012-07-03 13:14:49
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sd3824289

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议楼主在PCR仪上设计温度梯度！估计是退火温度的问题
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
5楼2012-07-03 15:44:06
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sd3824289 at 2012-07-03 15:44:06
建议楼主在PCR仪上设计温度梯度！估计是退火温度的问题

我用的是touch-down PCR,按说是没有问题的啊
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nothing isimpossible
6楼2012-07-03 17:06:32
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雅典娜1008

木虫 (著名写手)
我也遇到过一次，同样的试剂、同样的条件，就是重复不出来~
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平静、淡然、感恩
7楼2012-07-03 17:10:51
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kaikal

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-07-04 13:42:58
hraikeyan: 金币+3 2012-07-25 11:20:30
我觉得楼主做个温度梯度怎么样，实验这东西本来就存在着很大的偶然性的，摸索一下条件
其次看看你的引物或体系条件有没有出现问题，我想问下你用什么酶扩的？
还有就是你如果带不亮的话，可以先回收，以回收的产物为模板，进行扩增，也可以做个嵌式PCR，这样有可能效果会好些！
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加油！！！
8楼2012-07-04 07:23:14
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by kaikal at 2012-07-04 07:23:14
我觉得楼主做个温度梯度怎么样，实验这东西本来就存在着很大的偶然性的，摸索一下条件
其次看看你的引物或体系条件有没有出现问题，我想问下你用什么酶扩的？
还有就是你如果带不亮的话，可以先回收，以回收的产物 ...

我所用的酶rTaq酶 ，我一直用的是touch-downPCR，有两次做出来了，并且每管都有，i之后做的18管就只有三四个有条带的，而且没有之前的亮。i
请问关于引物检测怎么检测？
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nothing isimpossible
9楼2012-07-04 22:46:51
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西交-flx

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-05 13:45:27
条带比较暗的原因，很可能是这两个：其一，引物特异性不好，如果设计的引物特异性很好的话，一般p出来的条带是很亮很亮的，不会觉得很暗；其二，模板浓度很低很低，这样的话，p出来的条带也会感觉很暗；解决方法有两个：
  其一：把模板跑个电泳看看有无污染和查看模板浓度，如果出现的条带很暗，建议将模板浓缩下，再做pcr；其二，检查完模板没有问题的情况下，重新设计引物，将引物特异性提高，同时适当改变反应条件，p出来条带会很亮的，pcr 反应条件应该用 DNATap 聚合酶。
   祝实验顺利~
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10楼2012-07-05 09:57:35
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