应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因克隆
161/2返回列表12下一页
查看: 1828  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 基因克隆

我设计的一对引物，第一次PCR扩增时，发现扩增出来了片段，但个人感觉条带太暗，怕回收不回来，就扔了。第二次做，同样的体系，同样的条件，P出来，连一条条带都没有。而且第一次的让师兄看了，一点都不暗，说是能回收回来的。

请问各位，这是什么原因呢？为什么同样的条件，同样的体系，就是做不出来呢。
回复此楼

» 猜你喜欢
nothing isimpossible
1楼 2012-07-03 00:39:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-03 15:31:22
hraikeyan: 金币+2 2012-07-25 11:20:09
1：第一次P出了条带，请问是就目的条带一条呢，还是有多条条带，如果多条说明引物的特异性不是很好，需要摸条件，如果第一次就P出了一条且是目的条带的话，只是有点暗的话，可以试着加大模板量，增加PCR循环数.
2：最好对模板进行检测，看看是否污染或者浓度是否足够，酶，引物，buff，水之类的东西也得确保没有污染，这些都会不经意中影响PCR，可以一一排除.
祝楼主好运
赞一下 回复此楼
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
2楼2012-07-03 10:20:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Marado at 2012-07-03 10:20:26
1：第一次P出了条带，请问是就目的条带一条呢，还是有多条条带，如果多条说明引物的特异性不是很好，需要摸条件，如果第一次就P出了一条且是目的条带的话，只是有点暗的话，可以试着加大模板量，增加PCR循环数.
2： ...

请问模板怎么检测？是要做电泳吗？
赞一下 回复此楼
nothing isimpossible
3楼2012-07-03 12:22:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-07-03 12:22:42
请问模板怎么检测？是要做电泳吗？...

可以做个电泳看一下模板是否被污染，然后DNA浓度可以用分光光度计测量A260/280，如果在1.7-2.0之间，DNA可被认为是比较纯的.
赞一下 回复此楼
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
4楼2012-07-03 13:14:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sd3824289

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议楼主在PCR仪上设计温度梯度！估计是退火温度的问题
赞一下 回复此楼
坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
5楼2012-07-03 15:44:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sd3824289 at 2012-07-03 15:44:06
建议楼主在PCR仪上设计温度梯度！估计是退火温度的问题

我用的是touch-down PCR,按说是没有问题的啊
赞一下 回复此楼
nothing isimpossible
6楼2012-07-03 17:06:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

雅典娜1008

木虫 (著名写手)
我也遇到过一次，同样的试剂、同样的条件，就是重复不出来~
赞一下 回复此楼
平静、淡然、感恩
7楼2012-07-03 17:10:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kaikal

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-07-04 13:42:58
hraikeyan: 金币+3 2012-07-25 11:20:30
我觉得楼主做个温度梯度怎么样，实验这东西本来就存在着很大的偶然性的，摸索一下条件
其次看看你的引物或体系条件有没有出现问题，我想问下你用什么酶扩的？
还有就是你如果带不亮的话，可以先回收，以回收的产物为模板，进行扩增，也可以做个嵌式PCR，这样有可能效果会好些！
赞一下 回复此楼
加油！！！
8楼2012-07-04 07:23:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by kaikal at 2012-07-04 07:23:14
我觉得楼主做个温度梯度怎么样，实验这东西本来就存在着很大的偶然性的，摸索一下条件
其次看看你的引物或体系条件有没有出现问题，我想问下你用什么酶扩的？
还有就是你如果带不亮的话，可以先回收，以回收的产物 ...

我所用的酶rTaq酶 ，我一直用的是touch-downPCR，有两次做出来了，并且每管都有，i之后做的18管就只有三四个有条带的，而且没有之前的亮。i
请问关于引物检测怎么检测？
赞一下 回复此楼
nothing isimpossible
9楼2012-07-04 22:46:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西交-flx

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-05 13:45:27
条带比较暗的原因，很可能是这两个：其一，引物特异性不好，如果设计的引物特异性很好的话，一般p出来的条带是很亮很亮的，不会觉得很暗；其二，模板浓度很低很低，这样的话，p出来的条带也会感觉很暗；解决方法有两个：
  其一：把模板跑个电泳看看有无污染和查看模板浓度，如果出现的条带很暗，建议将模板浓缩下，再做pcr；其二，检查完模板没有问题的情况下，重新设计引物，将引物特异性提高，同时适当改变反应条件，p出来条带会很亮的，pcr 反应条件应该用 DNATap 聚合酶。
   祝实验顺利~
赞一下 回复此楼
10楼2012-07-05 09:57:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 hraikeyan 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 279求调剂 +4 红衣隐官 2026-03-21 4/200 2026-03-21 13:21 by zhukairuo
[考研] 299求调剂 +3 某某某某位 2026-03-21 3/150 2026-03-21 13:11 by zhukairuo
[考研] 085601调剂 358分 +3 zzzzggh 2026-03-20 4/200 2026-03-21 10:21 by luoyongfeng
[考研] 328求调剂，英语六级551，有科研经历 +4 生物工程调剂 2026-03-17 8/400 2026-03-21 02:12 by JourneyLucky
[考研] 085700资源与环境308求调剂 +12 墨墨漠 2026-03-18 13/650 2026-03-21 01:42 by JourneyLucky
[考研] 材料 336 求调剂 +3 An@. 2026-03-18 4/200 2026-03-21 01:39 by JourneyLucky
[考研] 271材料工程求调剂 +8 .6lL 2026-03-18 8/400 2026-03-21 00:58 by JourneyLucky
[考研] 【考研调剂】化学专业 281分，一志愿四川大学，诚心求调剂 +8 吃吃吃才有意义 2026-03-19 8/400 2026-03-21 00:49 by 刘国森
[考研] 304求调剂 +6 曼殊2266 2026-03-18 6/300 2026-03-21 00:32 by JourneyLucky
[考研] 材料专业求调剂 +6 hanamiko 2026-03-18 6/300 2026-03-21 00:24 by JourneyLucky
[考研] 085600材料与化工 +8 安全上岸！ 2026-03-16 8/400 2026-03-20 22:13 by luoyongfeng
[考研] 材料与化工 322求调剂 +4 然11 2026-03-19 4/200 2026-03-20 22:12 by luoyongfeng
[考研] 生物学调剂招人！！！ +3 山海天岚 2026-03-17 4/200 2026-03-19 21:34 by 怎么释怀
[考研] 288求调剂，一志愿华南理工大学071005 +5 ioodiiij 2026-03-17 5/250 2026-03-19 18:22 by zcl123
[考研] 0703化学调剂 +5 pupcoco 2026-03-17 8/400 2026-03-19 13:58 by houyaoxu
[考研] 0854可跨调剂，一作一项核心论文五项专利，省、国级证书40+数一英一287 +8 小李0854 2026-03-16 8/400 2026-03-18 14:35 by 搏击518
[考研] 考研化学学硕调剂，一志愿985 +4 张vvvv 2026-03-15 6/300 2026-03-17 17:15 by ruiyingmiao
[考研] 机械专硕325，寻找调剂院校 +3 y9999 2026-03-15 5/250 2026-03-16 19:58 by y9999
[考研] 304求调剂 +3 曼殊2266 2026-03-14 3/150 2026-03-16 16:39 by houyaoxu
[考研] 321求调剂 +5 大米饭！ 2026-03-15 5/250 2026-03-16 16:33 by houyaoxu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭