应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因克隆
161/2返回列表12下一页
查看: 2157  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 基因克隆

我设计的一对引物，第一次PCR扩增时，发现扩增出来了片段，但个人感觉条带太暗，怕回收不回来，就扔了。第二次做，同样的体系，同样的条件，P出来，连一条条带都没有。而且第一次的让师兄看了，一点都不暗，说是能回收回来的。

请问各位，这是什么原因呢？为什么同样的条件，同样的体系，就是做不出来呢。
回复此楼

» 猜你喜欢
nothing isimpossible
1楼 2012-07-03 00:39:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-03 15:31:22
hraikeyan: 金币+2 2012-07-25 11:20:09
1：第一次P出了条带，请问是就目的条带一条呢，还是有多条条带，如果多条说明引物的特异性不是很好，需要摸条件，如果第一次就P出了一条且是目的条带的话，只是有点暗的话，可以试着加大模板量，增加PCR循环数.
2：最好对模板进行检测，看看是否污染或者浓度是否足够，酶，引物，buff，水之类的东西也得确保没有污染，这些都会不经意中影响PCR，可以一一排除.
祝楼主好运
赞一下 回复此楼
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
2楼2012-07-03 10:20:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Marado at 2012-07-03 10:20:26
1：第一次P出了条带，请问是就目的条带一条呢，还是有多条条带，如果多条说明引物的特异性不是很好，需要摸条件，如果第一次就P出了一条且是目的条带的话，只是有点暗的话，可以试着加大模板量，增加PCR循环数.
2： ...

请问模板怎么检测？是要做电泳吗？
赞一下 回复此楼
nothing isimpossible
3楼2012-07-03 12:22:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-07-03 12:22:42
请问模板怎么检测？是要做电泳吗？...

可以做个电泳看一下模板是否被污染，然后DNA浓度可以用分光光度计测量A260/280，如果在1.7-2.0之间，DNA可被认为是比较纯的.
赞一下 回复此楼
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
4楼2012-07-03 13:14:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sd3824289

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议楼主在PCR仪上设计温度梯度！估计是退火温度的问题
赞一下 回复此楼
坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
5楼2012-07-03 15:44:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sd3824289 at 2012-07-03 15:44:06
建议楼主在PCR仪上设计温度梯度！估计是退火温度的问题

我用的是touch-down PCR,按说是没有问题的啊
赞一下 回复此楼
nothing isimpossible
6楼2012-07-03 17:06:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

雅典娜1008

木虫 (著名写手)
我也遇到过一次，同样的试剂、同样的条件，就是重复不出来~
赞一下 回复此楼
平静、淡然、感恩
7楼2012-07-03 17:10:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kaikal

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-07-04 13:42:58
hraikeyan: 金币+3 2012-07-25 11:20:30
我觉得楼主做个温度梯度怎么样，实验这东西本来就存在着很大的偶然性的，摸索一下条件
其次看看你的引物或体系条件有没有出现问题，我想问下你用什么酶扩的？
还有就是你如果带不亮的话，可以先回收，以回收的产物为模板，进行扩增，也可以做个嵌式PCR，这样有可能效果会好些！
赞一下 回复此楼
加油！！！
8楼2012-07-04 07:23:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by kaikal at 2012-07-04 07:23:14
我觉得楼主做个温度梯度怎么样，实验这东西本来就存在着很大的偶然性的，摸索一下条件
其次看看你的引物或体系条件有没有出现问题，我想问下你用什么酶扩的？
还有就是你如果带不亮的话，可以先回收，以回收的产物 ...

我所用的酶rTaq酶 ，我一直用的是touch-downPCR，有两次做出来了，并且每管都有，i之后做的18管就只有三四个有条带的，而且没有之前的亮。i
请问关于引物检测怎么检测？
赞一下 回复此楼
nothing isimpossible
9楼2012-07-04 22:46:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西交-flx

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-05 13:45:27
条带比较暗的原因，很可能是这两个：其一，引物特异性不好，如果设计的引物特异性很好的话，一般p出来的条带是很亮很亮的，不会觉得很暗；其二，模板浓度很低很低，这样的话，p出来的条带也会感觉很暗；解决方法有两个：
  其一：把模板跑个电泳看看有无污染和查看模板浓度，如果出现的条带很暗，建议将模板浓缩下，再做pcr；其二，检查完模板没有问题的情况下，重新设计引物，将引物特异性提高，同时适当改变反应条件，p出来条带会很亮的，pcr 反应条件应该用 DNATap 聚合酶。
   祝实验顺利~
赞一下 回复此楼
10楼2012-07-05 09:57:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 hraikeyan 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +17 爱看书的可乐 2026-08-26 19/950 2026-08-31 11:51 by xiangy672
[基金申请] 29号明天会评吗 +4 笨笨唐 2026-08-28 4/200 2026-08-31 09:30 by huixian257
[文学芳草园] 梦想 +4 myrtle 2026-08-26 4/200 2026-08-31 08:43 by 逸域隐帆
[基金申请] 基金不中，共勉 +12 eulota 2026-08-26 12/600 2026-08-31 08:42 by ZJTJZ
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +7 德尚中行 2026-08-27 8/400 2026-08-30 20:52 by purplejack
[考博] 找导师 +6 yuanjiabao 2026-08-29 7/350 2026-08-30 14:40 by 生科新手
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上） +6 gdd2018 2026-08-28 11/550 2026-08-30 08:58 by 超级无敌华子
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +15 晴天加油 2026-08-26 16/800 2026-08-29 18:28 by symmetry
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 面上合作单位盖章 +5 ssyjh 2026-08-27 5/250 2026-08-27 20:50 by gdfollow
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +5 zhaosm1982 2026-08-27 6/300 2026-08-27 16:00 by lfy8008
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭