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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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s100700677

新虫 (初入文坛)

[交流] PET-32a双酶切无法回收 已有8人参与

用SalI和NotI双酶切和t载体连接的目的片段及pET-32a空载体，发现目的片段能一次性顺利回收回来并且鉴定完全正确，但空载体酶切后不是没有条带（提的质粒已经鉴定，浓度和质量绝对么有问题），要不有带但经回收后鉴定时就消失了！！！！做了有四次了，只有一次有条带但鉴定没有了!剩下的都是回收时没有条带！！！！
      个人分析：
      1,酶没有问题，因为目的条带顺利回收！
      2,胶，缓冲液及试剂盒没有问题，因为目的条带顺利回收！
      3,没有降解问题，因为有没有酶切的载体做对照！且marker跑的很好！
      4,提的质粒没有问题吧？！鉴定过了，三条带非常完整，且亮度足够！
      5,酶切是在37度下进行，试过过夜，5小时，4小时，3小时！体系也试过40ul20ul的等等都优化了，结果都一样！
       这个实验以前做过，同样的实验，只不过最近在重复做，但就遇到这种情况了，遇到鬼了！
      希望各位能帮忙分析一下！不甚感激啊！！！！谢谢！！！！！
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1楼 2012-06-29 23:39:26
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syn1985

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
有条带回收后又消失了那就表明你的浓度不够 一次多做几管20ul体系的就可以了 如果pET-32a空载体双酶切下的片段很小建议直接用产物回收盒回收 跑一次琼脂糖还是很浪费的
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2楼2012-06-30 15:20:15
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yuzhiming

捐助贵宾 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我在怀疑你的pET-32a菌株有问题。
你提取的可能不是质粒，是基因组。
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3楼2012-07-01 11:32:03
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675250244

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
两种情况：
一、可能在酶切过程中存在污染，第一你用的灭菌水有没有问题？第二在37度酶切时你用封口膜把EP管的口封实了么？因为在这个温度下酶切水浴锅里的水可能会进去，会把质粒降解掉。
二、在酶切后跑电泳有其他杂带么？如果有的 话可能你加的酶的量太多了，这两个酶的特异性如果不太好的 话，在酶量过多的情况下就会把质粒切成小片段，而目的基因不会的原因是质粒是圆形的，比目的基因更好切，
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坚持每一天
4楼2012-07-01 12:22:17
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boyx

金虫 (正式写手)
★
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看到你这种 情况我也晕了！
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自由之思想，独立之灵魂
5楼2012-07-01 12:42:11
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我今天也要做跟楼主一模一样的实验.
空载体酶切后不是没有条带——这个很诡异，怎么说就算没切完全或者根本没有切上也该有条带的，可能的原因就是楼主酶切的时候质粒降解了或者被污染了.
要不有带但经回收后鉴定时就消失了——问一下楼主酶切后验证时候电泳条带清晰否，如果不清晰说明浓度太低，胶回收本来就有损失，不同试剂盒损失量不同，如果清晰的话，那就说明胶回收操作或者试剂盒有问题.
楼主逐一排除吧，祝楼主好运.
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
6楼2012-07-02 15:13:09
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★
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1：确定你的质粒pet是否正确？
2：酶切体系的问题，你说 “空载体酶切后不是没有条带（提的质粒已经鉴定，浓度和质量绝对么有问题），要不有带但经回收后鉴定时就消失了！！！！
如果酶切体系不合适，质粒太少，体系太大，点样量过少，根本不会有条带！
还有一种，有条带，回收后就没有条带了，那肯定是纯化/回收过程有问题，将质粒损失掉了！

个人建议，供参考！
祝好运！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
7楼2012-07-02 19:24:46
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小当佳

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主问题解决了吗？我也遇到了同样的问题，酶切后跑胶条带则挺亮的。但是一回收测浓度就特别低，纯度也不好，同时胶回收别的就可以，只有pET32a不行

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8楼2020-10-02 11:30:31
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junjieshao

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
9楼2020-10-03 00:43:47
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