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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 如何用DNS法测α-淀粉酶酶活
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protein_

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
scelab: 金币+5, MicEPI+1, 谢谢热心交流~ 2012-06-10 18:13:13
取1mL酶液于试管中，70℃保温15min，迅速冷却后，在40℃下预热15min，然后加入2mL40℃预热好的1%可溶性淀粉，摇匀后40℃下反应5min，迅速冷却并加入4mL0.4M氢氧化钠终止反应，然后取1mL反应液于试管中，加入1mLDNS，沸水浴5min，迅速冷却，定容至15mL，520nm下测定OD值。
参比：将酶液用氢氧化钠灭活，然后加入淀粉，其他步骤相同。
空白：利用1mL蒸馏水代替1mL反应液，其他步骤相同。
酶活力单位定义：上述条件下底物在1min催化生产1μmol还原糖的酶量定义为一个酶活力单位U（绝干）。
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4楼2012-06-08 10:17:16
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【答案】应助回帖

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rainwander: 金币+5, MicEPI+1, 鼓励交流 2012-06-09 08:39:28
引用回帖:
4楼: Originally posted by protein_ at 2012-06-08 10:17:16
取1mL酶液于试管中，70℃保温15min，迅速冷却后，在40℃下预热15min，然后加入2mL40℃预热好的1%可溶性淀粉，摇匀后40℃下反应5min，迅速冷却并加入4mL0.4M氢氧化钠终止反应，然后取1mL反应液于试管中，加入1mLDNS， ...

我对这个方法有看法：
1、如果淀粉酶不能承受70度保温15分钟，就会失活，我不是空口无凭的，在这个条件下我的很多酶都会失活。
2、没有提到缓冲系统，不能在酶的降解反应中保持恒定pH值。
3、氢氧化钠没有和DNS配在一起成为一个试剂，多了一个单独用来终止酶的降解的步骤。
4、“绝干”是什么意思？真菌固体培养所得到的曲？那么酶活力怎么算？再者，如果是真菌，操作多了之后孢子会飞。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2012-06-09 04:35:08
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冼亮淀粉酶

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【答案】应助回帖

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scelab: 金币+7, MicEPI+1, 谢谢热心交流~ :) 2012-06-10 18:13:34
我觉得我用的方法步骤少，酶降解反应所需体积小，便于大规模操作。

我用的DNS试剂配方如下（1L）：
四水合酒石酸钾钠200g，氢氧化钠20g，无水亚硫酸钠0.5g，结晶酚2g， DNS 10g，室温避光静置7天后可用。

我的操作步骤如下：
2.2.6.1.4淀粉酶活力的测定
（1）收集发酵上清液并作适当稀释。
（2）在2mL EP管中加入350微升含1%可溶性淀粉的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液，在已调整至需要温度的水浴锅中预热3min；
（3）取淀粉酶粗酶液50微升加入至缓冲液中并混匀；
（4）到达设定时间后，每管加0.8ml DNS试剂终止酶反应；
（5）沸水煮5 min后冷水冷却，瞬时离心将附着在管壁上的液体甩下；
（6）沸水煮5min的灭活上清液作同样处理作为对照；
（7）取200微升加到血清板上，测定540nm处光吸收值。

每次实验设三个重复，酶活力定义：在测定的pH和温度条件下，水解1%可溶性淀粉，每分钟产生1微摩尔还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。

至于干扰测定的酶，除了楼主所需要测定的3.2.1.1之外，还有楼上所提到想要70度灭活的3.2.1.2，还有3.2.1.3和3.2.1.10，它们降解淀粉的产物都是DNS法能测定的，都会干扰，DNS法不是专一的测定方法。我的很多真菌都能产3.2.1.1，最适作用温度都低于50度，在70度放那么久是会失活的。
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7楼2012-06-10 17:59:44
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