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求助引物的序列
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| 求Ntspa0685r 和PRBA338f的引物序列是什么？？？谢谢啦 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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dshlove
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good！ 2012-05-25 17:32:37
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good！ 2012-05-25 17:32:37
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我不知道你这是什么蛋白。 你要想确定是什么的话，可以去uniprot或者ncbi找出相应序列，下一步才能设计引物。 同时你要选择载体，是PET系列的还是其他的，再设计载体引物。 设计引物的方法很多，坚持几个原则就好： 引物设计原则： 1.找出这种细胞物种的PTN全长核苷酸序列 2.采用primer premier 5.0软件设计 引物设计应注意如下要点： 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应[2]。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) [6][7]。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6]。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行[8]。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。 如果文献上的这个基因跟你是同一物种来源的话 是可以运用别人的引物 看看他的引物是基因组的还是cDNA的。cDNA的可以直接用。基因组的就再看看了 好的引物对实验进程不会延缓 我觉得在涉及引物只要遵循以下的原则，一般是没什么问题!我是从来不借助什么专业软件来设计，按照自己的需要选取就是了，一般20bp，不浪费!到目前还没有失败过! 引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则: (1) 引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。 (2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm=4(G+C)+2(A+T). (3) 四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。 (4) 引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。 (5) 在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。 (6) 两引物之间尤其在3'端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。 (7) 引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。 (8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。 (9) 简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。 一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算: X mol/L= OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。 参考文献，自己研究 |
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- 附件 2 : 引物设计原则.doc
2012-05-25 17:29:32, 84.05 K
2012-05-25 17:29:33, 44.5 K
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