应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 一个简单实验的设计
汕头大学海洋科学接受调剂
101/1返回列表
查看: 2312  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

wshi85

木虫 (正式写手)

[求助] 一个简单实验的设计

懦懦的问下：我想做一个酶的基因的测序，是不是可以先提取总的RNA,之后是否可以直接就将总的rna进行cDNA合成（需不需要进行mRNA进行提取？）,在设计引物扩增mRNA的基因？本人还未涉足这些实验，但是马上要做了，所以请教大家
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

基因工程、分子技术、微生物理论 【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
很久没在虫虫上漂游了，觉得回归虫虫！
1楼 2012-05-22 16:56:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 哇，很热心哦 2012-05-23 13:58:46
wshi85: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-05-24 08:39:33
西瓜: 金币+2, Good！ 2012-05-27 12:51:19
西瓜: MolEPI+1, 补上 2012-05-27 12:51:33
嗯...........................
       不明白楼上各位的通用引物指的是什么................
       具体流程应该如下：
       1. 提取样品Total RNA
       2. 逆转录反应 肯定使用OligodT做引物 这样保证反转的是mRNA 同时若你的基因超过2000bp以上 很可能因为反转录酶效率问题而造成无法合成全长 这样的话 最好使用高质量Reverse Transcriptase 诸如SuperScript系列 同时辅以OligodT+Random Hexamer作为引物的方式才能够得到全长cDNA
       3. 设计需要你PCR基因全长的引物 不同的克隆策略需要设计不同的5'侧翼附加序列引物 此地方假设你只需要测序（采取TA克隆策略）结果引物扩增结果只要有ATG到终止密码子就可以了
       4. PCR你的cDNA（最好P前稀释你的cDNA 过量的cDNA模板会影响PCR效率 建议稀释2到5倍）得到正确条带后 胶回收产物
       5. 进行+A Tail反应 （假设你用的是高保真酶系列）后进行乙醇沉淀DNA（选做 不做的话假阳性高 但是不费这步力气）
       6. 连接T载体 转化感受态细胞 涂正确的抗性板
       7. 第二天挑选单菌落做鉴定 进行扩大培养 可以提质粒或直接菌液测序
       ....................................
       个人看法 若有说错请高手指点
赞一下(1人) 回复此楼
Let God do with it as He wills
4楼2012-05-23 00:44:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

crazymouse66

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+4, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-05-22 19:29:35
wshi85: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-05-24 08:40:02
先提取总RNA，然后利用通用引物反转录成cDNA，然后设计引物，进行PCR后电泳，观察在相应的mark处是否有条带出现，有的话切胶回收DNA，然后与载体进行连接，然后导入感受态细胞，一晚后挑菌落进行培养，再做菌液PCR看是否是你要的条带，是的话连着菌液送出去测序就可以了。（不用进行mRNA提取）
赞一下 回复此楼
2楼2012-05-22 19:22:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yingyifei

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-23 13:58:26
wshi85: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-05-24 08:40:08
mRNA的量一般比较少，直接用通用引物反转录，rRNA会对实验产生较大的影响，我觉得应该提出mRNA然后再反转录成cDNA。不过，如果tRNA的量可以达到一定的量，直接设计引物反转录也可以，用引物PCR可以特异性的扩增出需要的产物，然后再进行接下来的实验
赞一下 回复此楼
ying
3楼2012-05-22 23:51:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wshi85

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-05-23 00:44:52:
嗯...........................
       不明白楼上各位的通用引物指的是什么................
       具体流程应该如下：
       1. 提取样品Total RNA
       2. 逆转录反应 肯定使用OligodT做引物 这样保证反

嗯，那我想问下逆转录反应我打算买上海生工的试剂盒做，那是不是不需要在买“Reverse Transcriptase 诸如SuperScript系列 同时辅以OligodT+Random Hexamer”，猜测mRNA大概在2000bp左右
赞一下 回复此楼
很久没在虫虫上漂游了，觉得回归虫虫！
5楼2012-05-23 16:42:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wshi85

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by crazymouse66 at 2012-05-22 19:22:49:
先提取总RNA，然后利用通用引物反转录成cDNA，然后设计引物，进行PCR后电泳，观察在相应的mark处是否有条带出现，有的话切胶回收DNA，然后与载体进行连接，然后导入感受态细胞，一晚后挑菌落进行培养，再做菌液PCR看

我打算买试剂盒做cDNA,这个通用的引物就是指试剂盒附带的引物吗？还有做PCR时的mark是什么？需要自己在买的吗（pcr也打算买试剂盒）
赞一下 回复此楼
很久没在虫虫上漂游了，觉得回归虫虫！
6楼2012-05-23 16:45:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by wshi85 at 2012-05-23 16:42:10:
嗯，那我想问下逆转录反应我打算买上海生工的试剂盒做，那是不是不需要在买“Reverse Transcriptase 诸如SuperScript系列 同时辅以OligodT+Random Hexamer”，猜测mRNA大概在2000bp左右

嗯..............................
       没有必要 试剂盒的东西最好不要乱换 2000bp左右使用盒子自带RTase就够了 OligodT+Random Hexamer做引物也可以 这种长度的片段单单使用OligodT也是可以做出来的 看你自己选择了
       我前边说的那些都不是拿试剂盒的来做的。
赞一下 回复此楼
Let God do with it as He wills
7楼2012-05-23 18:47:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

孙启亮

金虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-05-23 00:44:52:
嗯...........................
       不明白楼上各位的通用引物指的是什么................
       具体流程应该如下：
       1. 提取样品Total RNA
       2. 逆转录反应 肯定使用OligodT做引物 这样保证反

牛啊，一个植物生理生化专业的专家让我们这些做分子微生物的情何以堪
赞一下 回复此楼
8楼2012-05-23 20:01:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sayaya
9楼2012-05-24 08:30:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

damaomao

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
10楼2012-05-25 11:36:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 wshi85 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 271求调剂 +31 2261744733 2026-04-11 35/1750 2026-04-13 20:24 by 学员JpLReM
[考研] 085600材料与化工，求调剂 +13 won_qii 2026-04-07 13/650 2026-04-13 14:22 by 张zhihao
[考研] 调剂求收留 +30 果然有我 2026-04-10 31/1550 2026-04-13 14:18 by 张zhihao
[考研] 297工科，求调剂? +13 河南农业大学-能 2026-04-12 13/650 2026-04-13 14:12 by dingyanbo1
[考研] 一志愿中南大学 0855 机械 286 求调剂 +10 不会吃肉 2026-04-12 10/500 2026-04-12 22:51 by 零零二
[考研] 求调剂，985材料与化工348分 +9 涵竹刘 2026-04-11 13/650 2026-04-12 22:40 by 涵竹刘
[考研] 296求调剂 +14 汪！？！ 2026-04-10 16/800 2026-04-12 10:48 by zhouyuwinner
[考研] 求助调剂，跨调 +12 X十甫寸Y 2026-04-11 12/600 2026-04-12 10:20 by zhouyuwinner
[基金申请] 山东省基金2026 +5 jerry681 2026-04-08 6/300 2026-04-12 08:33 by kudofaye
[考研] 070300化学279求调剂 +19 哈哈哈^_^ 2026-04-08 20/1000 2026-04-11 20:43 by stoner78
[考研] 求调剂，一志愿大连理工大学354分 +5 雨声余生 2026-04-11 6/300 2026-04-11 16:12 by 雨声余生
[考研] 机械专硕270求调剂，接受跨专业 +12 老师看看我吧aba 2026-04-09 14/700 2026-04-11 10:21 by laoshidan
[考研] 346，工科求调剂 +3 moser233 2026-04-09 3/150 2026-04-11 10:04 by zhq0425
[考研] 337求调剂 +4 研s. 2026-04-10 4/200 2026-04-11 08:57 by zhq0425
[考研] 青岛科技大学材料学院，环境学院调剂补录4月10日以前都可以 +3 1青科大。 2026-04-09 5/250 2026-04-10 09:58 by 翩翩一书生
[考研] 初试分332，一志愿报考西北工业大学， +11 故人?? 2026-04-09 11/550 2026-04-09 21:54 by JineShine
[考研] 本科211 工科085400 280分求调剂 可跨专业 +3 LZH（等待调剂中 2026-04-09 3/150 2026-04-09 21:29 by wutongshun
[考研] 070300化学 求调剂 +13 73372112 2026-04-08 13/650 2026-04-09 20:22 by maddjdld
[考研] 331求调剂 +5 luoxin0706. 2026-04-08 5/250 2026-04-08 22:15 by zhouyuwinner
[考研] 调剂求助（生物与医药） +6 @6952 2026-04-06 6/300 2026-04-07 23:52 by lys0704
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭