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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 一个简单实验的设计
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wshi85

木虫 (正式写手)

[求助] 一个简单实验的设计

懦懦的问下：我想做一个酶的基因的测序，是不是可以先提取总的RNA,之后是否可以直接就将总的rna进行cDNA合成（需不需要进行mRNA进行提取？）,在设计引物扩增mRNA的基因？本人还未涉足这些实验，但是马上要做了，所以请教大家
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很久没在虫虫上漂游了，觉得回归虫虫！
1楼 2012-05-22 16:56:08
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 哇，很热心哦 2012-05-23 13:58:46
wshi85: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-05-24 08:39:33
西瓜: 金币+2, Good！ 2012-05-27 12:51:19
西瓜: MolEPI+1, 补上 2012-05-27 12:51:33
嗯...........................
       不明白楼上各位的通用引物指的是什么................
       具体流程应该如下：
       1. 提取样品Total RNA
       2. 逆转录反应 肯定使用OligodT做引物 这样保证反转的是mRNA 同时若你的基因超过2000bp以上 很可能因为反转录酶效率问题而造成无法合成全长 这样的话 最好使用高质量Reverse Transcriptase 诸如SuperScript系列 同时辅以OligodT+Random Hexamer作为引物的方式才能够得到全长cDNA
       3. 设计需要你PCR基因全长的引物 不同的克隆策略需要设计不同的5'侧翼附加序列引物 此地方假设你只需要测序（采取TA克隆策略）结果引物扩增结果只要有ATG到终止密码子就可以了
       4. PCR你的cDNA（最好P前稀释你的cDNA 过量的cDNA模板会影响PCR效率 建议稀释2到5倍）得到正确条带后 胶回收产物
       5. 进行+A Tail反应 （假设你用的是高保真酶系列）后进行乙醇沉淀DNA（选做 不做的话假阳性高 但是不费这步力气）
       6. 连接T载体 转化感受态细胞 涂正确的抗性板
       7. 第二天挑选单菌落做鉴定 进行扩大培养 可以提质粒或直接菌液测序
       ....................................
       个人看法 若有说错请高手指点
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Let God do with it as He wills
4楼2012-05-23 00:44:52
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crazymouse66

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+4, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-05-22 19:29:35
wshi85: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-05-24 08:40:02
先提取总RNA，然后利用通用引物反转录成cDNA，然后设计引物，进行PCR后电泳，观察在相应的mark处是否有条带出现，有的话切胶回收DNA，然后与载体进行连接，然后导入感受态细胞，一晚后挑菌落进行培养，再做菌液PCR看是否是你要的条带，是的话连着菌液送出去测序就可以了。（不用进行mRNA提取）
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2楼2012-05-22 19:22:49
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yingyifei

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-23 13:58:26
wshi85: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-05-24 08:40:08
mRNA的量一般比较少，直接用通用引物反转录，rRNA会对实验产生较大的影响，我觉得应该提出mRNA然后再反转录成cDNA。不过，如果tRNA的量可以达到一定的量，直接设计引物反转录也可以，用引物PCR可以特异性的扩增出需要的产物，然后再进行接下来的实验
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ying
3楼2012-05-22 23:51:58
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wshi85

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-05-23 00:44:52:
嗯...........................
       不明白楼上各位的通用引物指的是什么................
       具体流程应该如下：
       1. 提取样品Total RNA
       2. 逆转录反应 肯定使用OligodT做引物 这样保证反

嗯，那我想问下逆转录反应我打算买上海生工的试剂盒做，那是不是不需要在买“Reverse Transcriptase 诸如SuperScript系列 同时辅以OligodT+Random Hexamer”，猜测mRNA大概在2000bp左右
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很久没在虫虫上漂游了，觉得回归虫虫！
5楼2012-05-23 16:42:10
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