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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 一个简单实验的设计
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 哇，很热心哦 2012-05-23 13:58:46
wshi85: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-05-24 08:39:33
西瓜: 金币+2, Good！ 2012-05-27 12:51:19
西瓜: MolEPI+1, 补上 2012-05-27 12:51:33
嗯...........................
       不明白楼上各位的通用引物指的是什么................
       具体流程应该如下：
       1. 提取样品Total RNA
       2. 逆转录反应 肯定使用OligodT做引物 这样保证反转的是mRNA 同时若你的基因超过2000bp以上 很可能因为反转录酶效率问题而造成无法合成全长 这样的话 最好使用高质量Reverse Transcriptase 诸如SuperScript系列 同时辅以OligodT+Random Hexamer作为引物的方式才能够得到全长cDNA
       3. 设计需要你PCR基因全长的引物 不同的克隆策略需要设计不同的5'侧翼附加序列引物 此地方假设你只需要测序（采取TA克隆策略）结果引物扩增结果只要有ATG到终止密码子就可以了
       4. PCR你的cDNA（最好P前稀释你的cDNA 过量的cDNA模板会影响PCR效率 建议稀释2到5倍）得到正确条带后 胶回收产物
       5. 进行+A Tail反应 （假设你用的是高保真酶系列）后进行乙醇沉淀DNA（选做 不做的话假阳性高 但是不费这步力气）
       6. 连接T载体 转化感受态细胞 涂正确的抗性板
       7. 第二天挑选单菌落做鉴定 进行扩大培养 可以提质粒或直接菌液测序
       ....................................
       个人看法 若有说错请高手指点
赞一下(1人) 回复此楼
Let God do with it as He wills
4楼2012-05-23 00:44:52
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