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wshi85木虫 (正式写手)
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[求助]
一个简单实验的设计
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| 懦懦的问下：我想做一个酶的基因的测序，是不是可以先提取总的RNA,之后是否可以直接就将总的rna进行cDNA合成（需不需要进行mRNA进行提取？）,在设计引物扩增mRNA的基因？本人还未涉足这些实验，但是马上要做了，所以请教大家 |
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 基因工程、分子技术、微生物理论 | 【分子生物】EPI帖 |
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10楼2012-05-25 11:36:21
crazymouse66
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atlanticwi
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嗯........................... 不明白楼上各位的通用引物指的是什么................ 具体流程应该如下： 1. 提取样品Total RNA 2. 逆转录反应 肯定使用OligodT做引物 这样保证反转的是mRNA 同时若你的基因超过2000bp以上 很可能因为反转录酶效率问题而造成无法合成全长 这样的话 最好使用高质量Reverse Transcriptase 诸如SuperScript系列 同时辅以OligodT+Random Hexamer作为引物的方式才能够得到全长cDNA 3. 设计需要你PCR基因全长的引物 不同的克隆策略需要设计不同的5'侧翼附加序列引物 此地方假设你只需要测序（采取TA克隆策略）结果引物扩增结果只要有ATG到终止密码子就可以了 4. PCR你的cDNA（最好P前稀释你的cDNA 过量的cDNA模板会影响PCR效率 建议稀释2到5倍）得到正确条带后 胶回收产物 5. 进行+A Tail反应 （假设你用的是高保真酶系列）后进行乙醇沉淀DNA（选做 不做的话假阳性高 但是不费这步力气） 6. 连接T载体 转化感受态细胞 涂正确的抗性板 7. 第二天挑选单菌落做鉴定 进行扩大培养 可以提质粒或直接菌液测序 .................................... 个人看法 若有说错请高手指点  |
4楼2012-05-23 00:44:52
