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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » T4l连接问题！！
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fly12365

铜虫 (初入文坛)

[求助] T4l连接问题！！

目前，T4连接遇到问题，老连不上，体系如下：
T4 1μL
PBI101-GFP 2μL(浓度10ng/μL)
片段 6μL(浓度50ng/μL)
10x Buffer 1μL
12℃ 过夜，感受态JM109 正常，
请大虾们帮助，卡在这了，五个基因一个也没构成，急死了！！
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1楼2012-04-30 22:29:16
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fly12365: 金币+3, ★有帮助 2012-05-01 08:53:59
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-02 13:36:49
嗯............
       最好先验证下T4是否还好，T4的Buffer中含有的ATP很容易在冻融过程中降解导致连接失败，所以T4的Buffer都是推荐分装使用，并且在冰上化融的，请楼主注意哦
       你可以先拿个已知质粒做酶切后，用T4连接看是否可行，若能够连接的话，问题就不是你的T4上咯，应该是你的片段切口和质粒切口对不上的
       祝实验顺利 若有说错请高手指点哦
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fly12365
Let God do with it as He wills
2楼2012-04-30 23:40:03
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快乐由自己go

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-02 18:51:44
建议调整优化插入片段和载体的molar ratio。
PS：很多生物公司的网站上都有相关的ratio conversion 计算器, 可以简化计算。
赞一下 回复此楼
3楼2012-05-01 03:34:46
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fly12365

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 快乐由自己go at 2012-05-01 03:34:46:
建议调整优化插入片段和载体的molar ratio。
PS：很多生物公司的网站上都有相关的ratio conversion 计算器, 可以简化计算。

那我再试一下吧，不行的话再交流
赞一下 回复此楼
4楼2012-05-01 08:38:11
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fly12365

铜虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-30 23:40:03:
嗯............
       最好先验证下T4是否还好，T4的Buffer中含有的ATP很容易在冻融过程中降解导致连接失败，所以T4的Buffer都是推荐分装使用，并且在冰上化融的，请楼主注意哦
       你可以先拿个已知质粒做 ...

谢谢，我再试一下吧
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5楼2012-05-01 08:39:09
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mhmtf

铜虫 (小有名气)
★
西瓜: 金币+1, 鼓励 2012-05-02 18:52:00
连不上是什么意思？是完全不长菌落还是长得都是自连的啊？你的片段是PCR产物还是酶切产物啊？如果是PCR产物的话，有没有经过酶切？是双酶切还是单酶切？
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gdfh
6楼2012-05-02 10:29:03
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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-02 18:52:08
看了你的体系，我觉得你可以从体系上下点功夫。

首先，载体：片段=1:3-5（也有1：10的），你的比值有问题没，你自己看一下。任何成分太多或太少，都不可以的。

然后你的条件是12℃ 过夜.
是根据说明书上面写的来做的吗？反正我没看见过说明书上写这个条件反应的。建议改一下条件（由于各种试剂盒的条件不尽相同，所以我建议你根据你的试剂盒类型来做）。

最后，祝实验顺利。
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7楼2012-05-02 15:18:23
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王zmm

新虫 (初入文坛)
要严格按照说明书上的步骤，应该放冰上的就不要在室温操作。pcr产物最好是经过纯化再做链接。祝你实验顺利
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8楼2012-05-03 09:22:27
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sayaya

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-03 13:47:01
首先，你的连接体系可以优化一下，一般，载体：片段=1:3-5（也可高达1：10，注意这里指的是摩尔比），你的比值有问题，起码远在1：10以上。你自己可以计算一下。片段比例太高，也不可取的。

另外，你的连接buffer 是 1 ul，条件是12℃ 过夜。
不知道你用的是哪个公司的产品，你确信是根据说明书上面写的来做的吗？
我很少见过10X 的连接buffer，也没见过12℃ 过夜的。希望是我少见多怪。
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9楼2012-05-03 10:19:26
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bin86

金虫 (小有名气)
楼主，请问pBI101的菌抗是什么？
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10楼2012-08-30 22:21:37
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