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fly12365

铜虫 (初入文坛)

[求助] T4l连接问题!!

目前,T4连接遇到问题,老连不上,体系如下:
T4 1μL
PBI101-GFP 2μL(浓度10ng/μL)
片段 6μL(浓度50ng/μL)
10x Buffer 1μL
12℃ 过夜,感受态JM109 正常,
请大虾们帮助,卡在这了,五个基因一个也没构成,急死了!!
Sample Text
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sayaya

铁杆木虫 (正式写手)

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-03 13:47:01
首先,你的连接体系可以优化一下,一般,载体:片段=1:3-5(也可高达1:10,注意这里指的是摩尔比),你的比值有问题,起码远在1:10以上。你自己可以计算一下。片段比例太高,也不可取的。

另外,你的连接buffer 是 1 ul,条件是12℃ 过夜。
不知道你用的是哪个公司的产品,你确信是根据说明书上面写的来做的吗?
我很少见过10X 的连接buffer,也没见过12℃ 过夜的。希望是我少见多怪。
9楼2012-05-03 10:19:26
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
fly12365: 金币+3, 有帮助 2012-05-01 08:53:59
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-02 13:36:49
嗯............
       最好先验证下T4是否还好,T4的Buffer中含有的ATP很容易在冻融过程中降解导致连接失败,所以T4的Buffer都是推荐分装使用,并且在冰上化融的,请楼主注意哦
       你可以先拿个已知质粒做酶切后,用T4连接看是否可行,若能够连接的话,问题就不是你的T4上咯,应该是你的片段切口和质粒切口对不上的
       祝实验顺利 若有说错请高手指点哦

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

Let God do with it as He wills
2楼2012-04-30 23:40:03
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快乐由自己go

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-02 18:51:44
建议调整优化插入片段和载体的molar ratio。
PS:很多生物公司的网站上都有相关的ratio conversion 计算器, 可以简化计算。
3楼2012-05-01 03:34:46
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fly12365

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 快乐由自己go at 2012-05-01 03:34:46:
建议调整优化插入片段和载体的molar ratio。
PS:很多生物公司的网站上都有相关的ratio conversion 计算器, 可以简化计算。

那我再试一下吧,不行的话再交流
4楼2012-05-01 08:38:11
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