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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DGGE实验问题
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lys000

铜虫 (小有名气)

[交流] DGGE实验问题 已有4人参与

最近刚开始做DGGE实验（研究土地渗滤处理系统中微生物多样性，以前读硕士时自己做过多次。现在做了5次DGGE了，一直出现同样的问题：DNA全部在上样孔，一点都没有跑，下面什么都没有。可见下图：

PCR引物：细菌通用引物 GC-341F和907R （560 bp，属于常用和经典的引物）
PCR扩增结果跑琼脂糖电泳检测过，亮度和特异性还可以，见附图。


DGGE条件：
6%的胶
变性梯度：20-80%
上样量：30 uL + 20 loading buffer
电压：140 V， 16h。  电流：50 mA左右
染色：gelred （后染，30min）

出现两次同样的问题（DNA根本没跑，但可以看到loading buffer 中的溴酚蓝明显在跑），做了如下分析：
1. 检查了TAE buffer的pH值，8.2左右，应该正常；
2.更换了全部试剂（全部换成sigma的），结果还是一样。
3.检查了电压和电流，应该正常啊，跑胶时刻明显看到溴酚蓝在跑，电流40-50mA应该也正常啊，也可明显看到正负极产生向上的气泡（电解过程）应该也正常啊。

我现在是在是不知道什么问题了？请大家帮忙分析分析啊。

PCR产物琼脂糖电泳结果



第一次的DGGE图片v1



第一次的DGGE图片v2



第二次的DGGE图片



全部更换为sigma的试剂后的DGGE图片v1



全部更换为sigma的试剂后的DGGE图片v2
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1楼 2012-04-28 11:26:17
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ctt1984

木虫 (正式写手)

初学者
★
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1, 这个引物没用过，但是根据个人经验来看过大了。一般通用引物我用的是199bp左右，很好用。细菌        338f (F)
ACTCCTACGGGAGGCAGCAG
518r (R) ATTACCGCGGCTGCTGG     48℃
GC序列：CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG
2，你上样量太大，一般5ul就够了，有时候2ul都可以。
3,一开始先用220v电压把DNA冲下来，之后用140v跑6-7小时或者80v跑16小时
4，还有一点我很怀疑哈，你小子是不是把胶灌反了？我们一般从上往下是低---高，你要是反的话跑不下来很正常。
我觉得主要就是这两点，其他的看了下没问题。
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好好做事，踏实做人！
2楼2012-05-01 04:25:11
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晴微雨浓

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼上的好！
我也遇到与楼主相似的问题，点样孔处很亮，样品好像没有跑下去，而且也不是每次都跑不下去，同样的条件，偶尔能跑下去。
还有，我想请问一下：您提到一开始先用220V电压把DNA冲下来，大概的时间是多久？是怎么的标准？
还有您说的可能是胶灌反了，这个应该不会吧？你们是怎么灌胶的啊？
希望能尽快收到您的回复！急求答案呀！！！
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3楼2012-05-26 09:12:27
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晴微雨浓

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
对了，楼主朋友：我想请问您一下，您的sigma的去离子甲酰胺是在哪家公司定的？我一直没有找到！求解！！！
先谢过了哈
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4楼2012-05-26 09:14:36
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木木夕星

新虫 (初入文坛)
★
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楼主，你的pcr产物条带好亮啊，你的体系是什么？用的试剂是什么啊？求分享啊
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5楼2014-01-08 15:38:10
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nanjizhou91

木虫 (小有名气)
★
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楼主，你后期测序吗？这个引物可以吗？
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期望与虫虫们交流学术问题
6楼2014-09-23 11:17:51
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