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DGGE实验问题 已有4人参与
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最近刚开始做DGGE实验（研究土地渗滤处理系统中微生物多样性，以前读硕士时自己做过多次。现在做了5次DGGE了，一直出现同样的问题：DNA全部在上样孔，一点都没有跑，下面什么都没有。可见下图： PCR引物：细菌通用引物 GC-341F和907R （560 bp，属于常用和经典的引物） PCR扩增结果跑琼脂糖电泳检测过，亮度和特异性还可以，见附图。 DGGE条件： 6%的胶 变性梯度：20-80% 上样量：30 uL + 20 loading buffer 电压：140 V， 16h。 电流：50 mA左右 染色：gelred （后染，30min） 出现两次同样的问题（DNA根本没跑，但可以看到loading buffer 中的溴酚蓝明显在跑），做了如下分析： 1. 检查了TAE buffer的pH值，8.2左右，应该正常； 2.更换了全部试剂（全部换成sigma的），结果还是一样。 3.检查了电压和电流，应该正常啊，跑胶时刻明显看到溴酚蓝在跑，电流40-50mA应该也正常啊，也可明显看到正负极产生向上的气泡（电解过程）应该也正常啊。 我现在是在是不知道什么问题了？请大家帮忙分析分析啊。  PCR产物琼脂糖电泳结果  第一次的DGGE图片v1  第一次的DGGE图片v2  第二次的DGGE图片  全部更换为sigma的试剂后的DGGE图片v1  全部更换为sigma的试剂后的DGGE图片v2 |
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5楼2014-01-08 15:38:10
ctt1984
木虫 (正式写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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1, 这个引物没用过，但是根据个人经验来看过大了。一般通用引物我用的是199bp左右，很好用。细菌 338f (F) ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 518r (R) ATTACCGCGGCTGCTGG 48℃ GC序列：CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG 2，你上样量太大，一般5ul就够了，有时候2ul都可以。 3,一开始先用220v电压把DNA冲下来，之后用140v跑6-7小时或者80v跑16小时 4，还有一点我很怀疑哈，你小子是不是把胶灌反了？我们一般从上往下是低---高，你要是反的话跑不下来很正常。 我觉得主要就是这两点，其他的看了下没问题。 |
2楼2012-05-01 04:25:11
3楼2012-05-26 09:12:27
4楼2012-05-26 09:14:36
30