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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 这样的电泳图片是否代表PCR扩增成功了？
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 继续W5 2012-04-28 09:28:24
引用回帖:
9楼: Originally posted by danyzj01 at 2012-04-27 20:47:01:
对了，后上传的第二张图中，左边和右边用的是不同的染料，左边第一个是粗提DNA，第二个是PCR产物，右边也是如此

另外，MARKER最小的那条100BP的带那里好像隐约还有一排什么条带，是污染吗？还是

100bp左右是剩余的没有进到产物里面的引物。引物虽然是单链，但是会 形成局部二级结构，也是可以被染色的。另外也可能是引物二聚体。这种现象是很常见的，几乎每次PCR都会有，不用太介意的。
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11楼2012-04-27 21:12:18
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danyzj01

银虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-04-27 21:09:19:
那PCR应该是ok了。你的EB是加在胶里的吧？EB在电场中，移动的方向跟DNA相反，也就是向着样品孔。所以经过一段时间电泳之后，胶的下半部分EB含量就少了，所以看起来就黑一些。

是GOLDEN VIEW，应该都是一样的吧，那就不是仪器的镜头脏什么的吧
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12楼2012-04-27 21:36:47
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danyzj01

银虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-04-27 21:12:18:
100bp左右是剩余的没有进到产物里面的引物。引物虽然是单链，但是会 形成局部二级结构，也是可以被染色的。另外也可能是引物二聚体。这种现象是很常见的，几乎每次PCR都会有，不用太介意的。

我也不知道提的这个基因组大概是什么，也没有设计引物，是借别人的引物随机试跑看看的，没想到真的成功了，会不会太巧了，应该不存在使用不当的引物而造成扩增的基因组不完整或者是错误吧？
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13楼2012-04-27 21:42:54
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honinglee

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-28 09:28:37
基本上确定是扩增出东西来了。但是不是你需要的目的条带就不得而知了。楼主可以多扩增几个循环，产物量大一些，回收后连个T载测个序看看是不是你要的就知道了。条带大小1800左右？2000bp的那张图的PCR扩增条带和600bp的扩增条带怎么不一样多？
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天下事有难易乎？为之，则难者亦易矣；不为，则易者亦难矣。
14楼2012-04-27 21:50:25
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danyzj01

银虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by honinglee at 2012-04-27 21:50:25:
基本上确定是扩增出东西来了。但是不是你需要的目的条带就不得而知了。楼主可以多扩增几个循环，产物量大一些，回收后连个T载测个序看看是不是你要的就知道了。条带大小1800左右？2000bp的那张图的PCR扩增条带和6 ...

忘记说了，600BP那个是2.5%的胶，跑了30分钟，2000BP的是1%的胶，跑了20分钟
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15楼2012-04-27 22:05:25
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liangxiuyan

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-29 17:29:57
按原理来说，应当确定你要的提取基因片段大小，然后根据marker才能确定成功与否
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每一段路途，都是为了成就一段梦想
16楼2012-04-28 08:36:43
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danyzj01

银虫 (正式写手)
danyzj01: 回帖置顶 2012-04-28 21:46:34
引用回帖:
16楼: Originally posted by liangxiuyan at 2012-04-28 08:36:43:
按原理来说，应当确定你要的提取基因片段大小，然后根据marker才能确定成功与否

将PCR产物直接进行第二次PCR，结果引物剩那么多，是怎么回事？
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17楼2012-04-28 21:46:26
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liangxiuyan

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
西瓜: 金币+1, 鼓励 2012-04-29 17:30:20
引物二聚体多，一个是设计问题，还有就是加的量比较大，可以摸索一下浓度。也可以提高退火温度试试
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每一段路途，都是为了成就一段梦想
18楼2012-04-29 08:25:19
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danyzj01

银虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by liangxiuyan at 2012-04-29 08:25:19:
引物二聚体多，一个是设计问题，还有就是加的量比较大，可以摸索一下浓度。也可以提高退火温度试试

设计的量大 ，指的是引物，还是DNA的浓度？引物只加了0.25微升，100微摩尔的引物原液
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19楼2012-04-29 08:57:42
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jocelyn2012

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流！欢迎新朋友啊~ 2012-04-29 17:30:42
引用回帖:
17楼: Originally posted by danyzj01 at 2012-04-28 21:46:26:
将PCR产物直接进行第二次PCR，结果引物剩那么多，是怎么回事？
3c/08/1725610_1335620783_810.jpg

最底下的条带是引物二聚体，即引物互P，
你最初引物才加多少，怎么可能那么亮，是PCR把量扩增了。这是正常现象，若要测序，建议把目的条带割胶回收
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20楼2012-04-29 13:57:19
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