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Oligo 6.0引物评价、两温度循环、PCR退火温度的选择问题
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我用CODEHOP法设计了简并引物，对cDNA第一链进行PCR。但用Oligo 6.0对引物评价时，在对PCR一项评价时，总会出现下面一句话： Comments: Two-temperature PCR recommended: (68°/94°) 查相关资料，得知这是说两温度循环PCR的条件可设为68°和94°。但对于两温度循环，我很不明白，将退火和延伸合并，设温度为68°吗？94度是指变性温度吗？时间要设多长呢？什么情况下适合用两种温度循环呢？两种温度循环和正常PCR相比，有什么特别之处呢？ 还有，如果进行正常的PCR，退火温度的选择是按照Oligo 6.0上的说明吗？ 我设计的引物，Oligo 6.0上指示：Optimal Annealing Temperature: 60.3° (Max: 72.0°)，实际PCR时，我要怎样选择退火温度呢？是60.3°，还是在60.3°－72.0°之间都可以？还是，选择Comments里说的选择68°？ 有关引物的评价和PCR条件，我不是很清楚，请大家帮个忙，感激不尽！！！ |
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