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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助：关于考马斯亮蓝法测定蛋白质
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329939815

木虫 (正式写手)

[求助] 求助：关于考马斯亮蓝法测定蛋白质

本人最近测牛血清蛋白（1mg/ml），100微升（加入3ml考马斯亮蓝）的吸光度只有0.332。
相关系数0.9866，奔溃！
                                  第一次做这个东西，迷茫了，不知道出了什么问题！
有没有在武汉的学校用这种方法测蛋白的虫友呀？求认识...求教！急，谢谢！！！！！
本人在武汉...继续请教，谢谢！
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1楼 2012-04-19 15:31:41
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

nakice

铁杆木虫 (正式写手)
你是在做蛋白标准曲线吗？？
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奋斗就是生活，人生只有前进
3楼2012-04-19 16:10:46
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaohq1209: 金币+2, (*^__^*) 嘻嘻…… 2012-04-19 22:54:29
329939815: 金币+3 2012-06-08 15:55:51
做蛋白定量通常都需要做3次重复，取平均值，标准曲线得到两个9是没问题的
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6楼2012-04-19 18:21:18
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colorfulmiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
329939815: 金币+3, ★有帮助 2012-06-24 23:48:58
329939815: 金币+2 2012-06-24 23:50:19
考马斯染液不是G-250吗？R-250我们是用来进行电泳染色的呀 而且是需要过滤的 考马斯不容易溶解并且容易有杂质在里面，
另外你的标准蛋白加入后混匀了吗？测吸光值的时候比色皿洗干净了吗？
我们在做标曲的时候用96孔板酶标仪比色做出来的标曲相关系数能达到三个九 你要有条件用酶标仪比色会更好的~
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亦余心之所善兮虽九死其犹未悔
12楼2012-04-20 10:45:47
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telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain
R250一般用于SDS-PAGE胶的染色，G250一般用于初步检测是否有蛋白
R250(Coomassie brilliant blue R250).C45H44O7H3S2Na,MW=824,λmax=560―590nm.染色灵敏度比氨基黑高5倍.尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色.但蛋白质浓度超出一定范围时,对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律,用作定量分析时要注意这点.
G250, 又名Xylene brilliant cyaninG.比考马斯亮蓝R250多二个甲基.MW=854;λmax=590―610nm.染色灵敏度不如R250,但比氨基黑高3倍.优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体,能选择地染色蛋白而几乎无本底色.所以常用于需要重复性好和稳定的染色,适于作定量分析.
G250中的G就是Green，偏绿，R250中的R代表Red，偏红，在进行小分子量蛋白的Tricine电泳是常用G250染色，至于加热，染和脱色都可以加热，但都是在急需知道结果的情况下采用，加热后染的背景色很重脱色时间就长而且很难将背景色脱干净，脱色液经常加热会导致固定剂的会发，很快脱色剂就没用了，脱色效果很差，而且加热挥发出来的甲醛对呼吸道有刺激作用因此尽量不要加热！


G250配完是棕红的，遇蛋白才会变蓝
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329939815
我的路靠我的脚踩出来！！！不走寻常路！！！
13楼2012-04-20 11:15:30
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wc4646

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
329939815: 金币+3, ★有帮助 2012-06-24 23:49:13
329939815: 金币+2 2012-06-24 23:50:07
1. 考马斯亮蓝工作液需要过滤，配制时选用超纯水配制。配制后不可放置时间过长。
2. 牛血清蛋白精确定量，可以将其测定体积扩大至0.5ml+0.5ml超纯水+2ml考马斯亮蓝工作液。
3. 确定测定仪器及条件无误。595nm处测定，仪器参数常规设置。
4. 实验至少3次重复，求其平均值进行计算分析。
祝好！
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15楼2012-04-20 13:01:37
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普通回帖

8638600

木虫 (正式写手)
你检测波长是多少啊?看看有没有弄错~~
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2楼2012-04-19 16:09:26
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329939815

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 8638600 at 2012-04-19 16:09:26:
你检测波长是多少啊?看看有没有弄错~~

595nm
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4楼2012-04-19 18:00:47
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329939815

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by nakice at 2012-04-19 16:10:46:
你是在做蛋白标准曲线吗？？

是的
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5楼2012-04-19 18:02:12
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mnzn

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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329939815: 金币+1, ★有帮助, 我错了！ 2012-04-20 13:16:53
329939815: 金币+6 2012-06-08 15:56:15
确定是考马斯亮蓝的G-250，我以前做过用错染料了，呵呵
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生活就像心电图，想要一帆风顺除非你死了
7楼2012-04-20 08:45:27
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zzqbaidu

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个方法我也试了好多次  做了好多次  不太好弄 过滤下染液试试
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帮忙点下我的网站http://www.yayadan.com 欢迎光临！
8楼2012-04-20 08:55:10
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329939815

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zzqbaidu at 2012-04-20 08:55:10:
这个方法我也试了好多次  做了好多次  不太好弄 过滤下染液试试

过滤了的...你做好没？
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9楼2012-04-20 09:12:04
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telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain
329939815: 回帖置顶 2012-06-08 15:56:01
考蓝配的颜色对吗？棕红色的
如果都没问题，那就是操作时小心点，别引进其他蛋白的污染，
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我的路靠我的脚踩出来！！！不走寻常路！！！
10楼2012-04-20 09:26:10
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