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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做过跨膜蛋白原核表达的战友过来看看哦
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幸福常在

铁虫 (初入文坛)

[求助] 做过跨膜蛋白原核表达的战友过来看看哦 已有1人参与

我的跨膜蛋白，具七次跨膜结构，用过PET28a载体分别转过BL21（DE3）和具有稀有密码子的transset（DE3)宿主,同时做过两遍的时间诱导（2h，4h，6h）和浓度诱导（0.2,0.6,1.0,1.4的IPTG），同时做是其他基因完美诱导出来了，就是这个具有跨膜结构的一直SDS-PAGE无条带，现在转换PET32a载体转BL21（de3），但是一直连接不上，目前原核表达已经耗时近2个月共8次了，甚为纠结，含泪求各位战友指教！！！
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1楼 2012-04-09 09:45:31
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

beimi

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2013-01-21 22:18:40
我也是做这个的，跨莫蛋白，我是做翻译后修饰，你的iptg浓度太高了，我最多才用0.05，用哦
0。01也行，低温，段时间，我做了三个月了，快昨晚了，祝好听

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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8楼2013-01-18 07:19:40
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黄油411

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
幸福常在: 回帖置顶 2012-04-11 19:58:48
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-12 13:41:03
跨膜蛋白的原核表达一般都不怎么靠谱的，还要看运气的。建议将跨膜区逐个去掉后再表达。不管表达不表达，克隆肯定能连上的，再检查下是不是哪步出现错误了。你表达的7跨膜蛋白是不是G蛋白受体系列的啊
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专心做抗体
2楼2012-04-09 16:22:36
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普通回帖

幸福常在

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 黄油411 at 2012-04-09 16:22:36:
跨膜蛋白的原核表达一般都不怎么靠谱的，还要看运气的。建议将跨膜区逐个去掉后再表达。不管表达不表达，克隆肯定能连上的，再检查下是不是哪步出现错误了。你表达的7跨膜蛋白是不是G蛋白受体系列的啊

恩，是的，是昆虫or83b气味受体，G蛋白偶联受体，几乎整个蛋白都是跨膜，如果要去掉跨膜结构的话，估计整个蛋白就都是断裂的了，求指教
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3楼2012-04-11 19:58:09
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黄油411

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 幸福常在 at 2012-04-11 19:58:09:
恩，是的，是昆虫or83b气味受体，G蛋白偶联受体，几乎整个蛋白都是跨膜，如果要去掉跨膜结构的话，估计整个蛋白就都是断裂的了，求指教

没有啥太好的办法，先去掉1-2个跨膜区，要是能表达出来就继续去。不过要看你这个蛋白的用途了
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专心做抗体
4楼2012-04-12 09:12:40
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黄-鸣

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-11 15:54:59
如果是用pcr产物做连接，有可能是酶切位点保护碱基太短，酶切效率太低。楼主做的啥虫？我在做一个蛾子的or83b表达，32a也还没表达出来。
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5楼2012-10-11 09:36:33
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xl0071334

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

你可以选用一些融合标签进行融合表达。即便不表达但是应该能连接上去的
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6楼2013-01-08 14:03:35
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zhangna0320

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2013-01-21 22:18:33
楼主，后来你怎么解决的呢，我现在也在做膜蛋白的表达，做原核表达也是不能表达出来啊，用PET32a，但是转BL21中，平板不长，不知道为什么，后来好不容易长了几个菌，但是做时表达，没有表达的条带，很想知道你后来怎么做的？
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7楼2013-01-17 14:15:04
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莲绽夜阑

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by beimi at 2013-01-18 07:19:40
我也是做这个的，跨莫蛋白，我是做翻译后修饰，你的iptg浓度太高了，我最多才用0.05，用哦
0。01也行，低温，段时间，我做了三个月了，快昨晚了，祝好听

我刚开始做蛋白表达，也是膜蛋白，我做膜蛋白胞外部分原核表达，蛋白比较大，70KD,想问问你表达的蛋白多大？用的什么载体和细胞？像我这种情况能不能可能表达出可溶蛋白？
新手，求指教！
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对于一切一切的黑暗，至少不要绝望
9楼2013-04-17 09:49:00
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九戒不是戒

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by beimi at 2013-01-18 07:19:40
我也是做这个的，跨莫蛋白，我是做翻译后修饰，你的iptg浓度太高了，我最多才用0.05，用哦
0。01也行，低温，段时间，我做了三个月了，快昨晚了，祝好听

我最近也在做G蛋白偶联受体的原核表达，1个月了，一点结果都木有，我用的是载体是PET-32a,表达菌rosseta，IPTG分别0.4,0.6,0.8mM，时间10小时，15小时，温度分别20°，34°。培养基TB，分别试了加百分之2的葡萄糖和不加葡萄糖。    想问下你是怎么做的，求助啊
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10楼2013-08-22 03:51:32
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