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幸福常在

铁虫 (初入文坛)

[求助] 做过跨膜蛋白原核表达的战友过来看看哦 已有1人参与

我的跨膜蛋白，具七次跨膜结构，用过PET28a载体分别转过BL21（DE3）和具有稀有密码子的transset（DE3)宿主,同时做过两遍的时间诱导（2h，4h，6h）和浓度诱导（0.2,0.6,1.0,1.4的IPTG），同时做是其他基因完美诱导出来了，就是这个具有跨膜结构的一直SDS-PAGE无条带，现在转换PET32a载体转BL21（de3），但是一直连接不上，目前原核表达已经耗时近2个月共8次了，甚为纠结，含泪求各位战友指教！！！
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1楼 2012-04-09 09:45:31
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九戒不是戒

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by beimi at 2013-01-18 07:19:40
我也是做这个的，跨莫蛋白，我是做翻译后修饰，你的iptg浓度太高了，我最多才用0.05，用哦
0。01也行，低温，段时间，我做了三个月了，快昨晚了，祝好听

我最近也在做G蛋白偶联受体的原核表达，1个月了，一点结果都木有，我用的是载体是PET-32a,表达菌rosseta，IPTG分别0.4,0.6,0.8mM，时间10小时，15小时，温度分别20°，34°。培养基TB，分别试了加百分之2的葡萄糖和不加葡萄糖。    想问下你是怎么做的，求助啊
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10楼2013-08-22 03:51:32
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黄油411

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
幸福常在: 回帖置顶 2012-04-11 19:58:48
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-12 13:41:03
跨膜蛋白的原核表达一般都不怎么靠谱的，还要看运气的。建议将跨膜区逐个去掉后再表达。不管表达不表达，克隆肯定能连上的，再检查下是不是哪步出现错误了。你表达的7跨膜蛋白是不是G蛋白受体系列的啊
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专心做抗体
2楼2012-04-09 16:22:36
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幸福常在

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 黄油411 at 2012-04-09 16:22:36:
跨膜蛋白的原核表达一般都不怎么靠谱的，还要看运气的。建议将跨膜区逐个去掉后再表达。不管表达不表达，克隆肯定能连上的，再检查下是不是哪步出现错误了。你表达的7跨膜蛋白是不是G蛋白受体系列的啊

恩，是的，是昆虫or83b气味受体，G蛋白偶联受体，几乎整个蛋白都是跨膜，如果要去掉跨膜结构的话，估计整个蛋白就都是断裂的了，求指教
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3楼2012-04-11 19:58:09
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黄油411

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 幸福常在 at 2012-04-11 19:58:09:
恩，是的，是昆虫or83b气味受体，G蛋白偶联受体，几乎整个蛋白都是跨膜，如果要去掉跨膜结构的话，估计整个蛋白就都是断裂的了，求指教

没有啥太好的办法，先去掉1-2个跨膜区，要是能表达出来就继续去。不过要看你这个蛋白的用途了
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专心做抗体
4楼2012-04-12 09:12:40
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