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琼脂糖电泳没有条带，但是DNA浓度很高，1000+ng/ul maker有条带
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| Sample Text本人最近几次PCR产物跑胶总是没条带，操作和以往经验一样，用1%的TBE琼脂糖凝胶电泳，跑25分钟左右，但是一直都没有条带，maker可以正常跑出，目的片段是750bp左右的片段，换了人操作，结果也是一样，但是测PCR产物DNA浓度的时候又有约1000+ng/ul，这是什么情况啊，求各位高人分析指点，小弟不甚感激！！！ |
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 分子生物 | 【分子生物】EPI帖 |
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atlanticwi
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针对你这种情况，我也明白你为什么扩不出来了，PCR是有模板量限制的，这很多人知道但不明白为什么。 举个例子来说，为什么PCR到40多循环进入平台期后就不再有高扩增效率，这并非是酶不强劲，现代重组工业生产的酶即使是在PCR循环后期仍旧活力很高。 同样这也不是组份消耗过多的问题，如果你加入两倍量dNTP、引物，到40循环左右仍旧会进入平台期，扩增效率下降。 问题在哪里，是聚合酶有倾向于结合完整双链的特点，如果退火条件稍差，模板-引物结合的趋势仍会逊于模板模板相结合，造成其对聚合酶的竞争效应，所以初始模板过多和循环一定程度这两种情况可以说是等同的。 所以，若你扩不出来东西，首先尝试调整条件，引物一般只要不是很夸张，一般PCR的应用是没有什么特异特异性的可言的  |
6楼2012-04-10 21:02:58
atlanticwi
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【答案】应助回帖
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嗯..................... 说实话，你这个操作是个失误哦，你测PCR产物是通过分光光度法测定的吗？如果是，绝对不能这么操作的啊，原因有以下： 1. 你如何调Blank，PCR体系混杂，难道你要再配一管没模板的PCR混合液去调Blank的吗？ 2. PCR都是成指数（理想状态）扩增，数十个循环的正常PCR产物去测光密度，可能都会暴表了。 3. 分光光度法又没法分辨你的产物和其他类型核酸的，所以你的引物在里边也会正常读出来的 所以确定有没有PCR产物只能是电泳或荧光定量的方法来检验 祝实验顺利，若有说错请高手指正哦 |
2楼2012-04-07 23:36:00
wtyyyyy1988
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