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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » Amp、IPTG和X-gal的使用
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华俊

金虫 (小有名气)

[求助] Amp、IPTG和X-gal的使用

Amp、IPTG使用灭菌水配制后和X-gal使用二甲基甲酰胺（DMF）配制后放在-20度保存，分别能保存多久呀？
还有就是大家在使用这两种试剂是涂板的时候和菌液一起加入还是在倒平板的时候就加入培养基呢，使用浓度和使用量分别是多少呢？培养过夜后蓝白斑显色不明显，为什么放4度3--4小时后显色会比较好呢？我使用AMP的终浓度是100微克/毫升，但是感觉还是长很多杂菌，有没有同学尝试用更高浓度去筛选？
谢谢各位大侠的帮助啦！
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多一份快乐少一分烦恼！
1楼 2012-03-30 11:04:39
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华俊

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 路人甲007 at 2012-03-30 13:57:42:
简单的方法就是做完转化后做一轮菌落PCR，这可以初步筛选阳性克隆，然后选取阳性克隆送测序，保证目的基因正确插入之后才能进行后续表达。

蓝白斑筛选也会有假阳性和假阴性的结果的，本来就不是很准确，这种方 ...

我构建的表达载体都测序了，PET-32a+目的片段都测序了，没问题，但是转化到BL21(DE3)或rosetta中就表达不出来，不过感受态都是从同学那里找的，可能保存时间太久了...谢谢！
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多一份快乐少一分烦恼！
5楼2012-03-30 21:08:35
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bingdong05

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
华俊: 金币+5, ★★★很有帮助, 1 2012-03-30 11:40:23
amp100微克/毫升，其实你可以试着提高下浓度，我曾经加错一倍，结果照样能长出来，倒平板时加入，前提培养基冷却至50度左右，另外不需要蓝白筛选的，其实挑转化子的时候多挑几个，一般没有问题，但是不知道你的DH5a等感受态是买的还是自己做的，我试过商业化的，不同批次的差别很大，不如自己做的
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2楼2012-03-30 11:21:49
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华俊

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bingdong05 at 2012-03-30 11:21:49:
amp100微克/毫升，其实你可以试着提高下浓度，我曾经加错一倍，结果照样能长出来，倒平板时加入，前提培养基冷却至50度左右，另外不需要蓝白筛选的，其实挑转化子的时候多挑几个，一般没有问题，但是不知道你的DH ...

谢谢啦，我也在考虑提高氨苄的浓度来做做，DH5a转化效率比较高，这个我知道，一次就成功啦，但是我现在做的是蛋白表达，要把连接产物转化到DE3系列的表达菌种，遇到了难题啦，转化后板上也长很多菌，可是挑菌摇菌，表达就是不成功，前面有同学做过这个实验，目的片段可能不会有问题的，酶切、测序都正确，现在我怀疑是表达感受态的问题了.....想换种方式筛选
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多一份快乐少一分烦恼！
3楼2012-03-30 11:48:54
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路人甲007

木虫 (正式写手)

小七
简单的方法就是做完转化后做一轮菌落PCR，这可以初步筛选阳性克隆，然后选取阳性克隆送测序，保证目的基因正确插入之后才能进行后续表达。

蓝白斑筛选也会有假阳性和假阴性的结果的，本来就不是很准确，这种方法我也用过。
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与人玫瑰手有余香
4楼2012-03-30 13:57:42
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